安賀拉滴眼液治療兔干眼癥的免疫病理學(xué)研究

　　目的 觀察安賀拉滴眼液應(yīng)用于兔干眼癥治療的免疫病理學(xué)變化，初步探討安賀拉滴眼液治療干眼癥的可能機制。方法 新西蘭白兔20只，制作堿燒傷干眼模型，隨機分為對照組和安賀拉組，分別滴生理鹽水和安賀拉滴眼液。用藥４周后應(yīng)用印跡細胞學(xué)和免疫病理學(xué)方法檢測結(jié)膜杯狀細胞密度、MUC5AC陽性細胞率和炎性細胞浸潤密度。結(jié)果 對照組結(jié)膜炎性細胞浸潤密度高于安賀拉組，安賀拉組杯狀細胞密度和MUC5AC陽性細胞率均大于對照組（P<0.05）。結(jié)論 安賀拉滴眼液可以降低兔眼表的炎癥反應(yīng)，促進杯狀細胞增殖，在干眼癥治療方面具有一定的應(yīng)用前景。
　　
　　Abstract:Objective To discuss the mechanism of ketorolac tromethmine eye drops in rabbits dry eye with alkali burns in conjunctiva by observing the immunopathologic process after it was used. Methods Twenty rabbit models were established by burning with alkali in conjunctiva, and then divided into two groups randomly: the experimental group treated with ketorolac tromethmineeye drops and the control group treated with saline. By using immunopathologic techniques and impression cytology test, density of goblet cell, positive rate of MUC5AC and density of inflammatory cell in conjunctiva were studied the 4th week after drug used. Result The density of goblet cell, and positive rate of MUC5AC in experimental group was higher than that of control group and lower in the density of inflammatory cell（P<0.05）。 Conclusion Ketorolac tromethmine eye drops can reduce ocular surface inflammation and increase the number of goblet cells in rabbits, suggesting it is valuable to dry eye.
　　
　　Key words: ketorolac tromethmine；dry eye；rabbit；immunopathology
　　
　　干眼是指任何原因引起的淚液質(zhì)或量及動力學(xué)的異常，導(dǎo)致淚膜不穩(wěn)定和(或) 眼表面的異常，并伴有眼部不適癥狀的一類疾病。干眼的主要癥狀有眼部干燥、異物感、視疲勞、畏光及視力下降等，輕者影響工作和生活，嚴重者可導(dǎo)致眼表尤其是角膜組織干燥、融解、穿孔，嚴重危害視功能［１］。干眼作為最常見眼表疾病有日趨增多的趨勢，其藥物治療方法多種［２］：淚液替代療法、黏液溶解藥、局部自家血清、抗生素等。隨著干眼發(fā)病機制的深入研究，現(xiàn)已認識到由炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與幾乎所有類型干眼的病理生理過程。本研究采用新型藥物——安賀拉滴眼液作用兔干眼模型，研究其療效及可能的作用機制。
　　
　　1  材料與方法
　　
　　1.1  主要儀器與試劑Leica MEL53 型眼科手術(shù)顯微鏡 （瑞士WILD LEITZ 公司），YZ?5CSI型裂隙燈顯微鏡（蘇州醫(yī)療儀器廠），Olympus?10AK照相顯微鏡（日本歐林巴斯光學(xué)公司），低溫恒冷切片機 （美國Leica公司），安賀拉滴眼液（Acular,美國Allergan公司產(chǎn)品），16mm×6mm的濾紙條，1mol/L的NaOH（廣州化學(xué)試劑廠），1%熒光素鈉溶液，1%虎紅溶液（廣西梧州制藥股份有限公司），免疫組化試劑盒和MUC5AC抗體（美國Sigma公司）。
　　
　　1.2  動物選擇與分組　　健康成年新西蘭白兔20只，雌雄各半，體質(zhì)量2.0～2.5 kg。隨機分為實驗組和對照組，每組10只，右眼為實驗眼。購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK (粵)2003-0002， 粵監(jiān)證字2006A001。
　　
　　1.3  實驗方法　　50 mg/2 mL鹽酸氯丙嗪＋100 mg/2 mL氯氨酮肌肉注射麻醉兔，切除右眼第三眼瞼，并用2張16 mm×6 mm的濾紙條蘸1 mol/L的NaOH溶液置于距兔角膜緣上方2 mm的結(jié)膜上，90 s后立即用100 mL 生理鹽水反復(fù)沖洗結(jié)膜囊。術(shù)后對照組局部應(yīng)用生理鹽水滴眼，每日3次；實驗眼局部應(yīng)用安賀拉滴眼液，每日3次。用藥4周后行結(jié)膜印跡細胞學(xué)檢查，并取病變區(qū)結(jié)膜行組織病理學(xué)檢查和免疫組化染色檢測特異性黏蛋白MUC5AC的表達。
　　
　　1.3.1  印跡細胞學(xué)檢查及PAS染色     將孔徑為0.2 μm的醋酸纖維膜剪成3 mm×3 mm大小，浸入蒸餾水3～4 h，以消除濾紙表面活性，取出晾干高壓消毒備用。檢查前結(jié)膜囊先滴1％愛爾卡因1滴，5 min后，濾紙吸去穹隆部淚液，將醋酸纖維膜的粗糙面貼于距上方角膜緣2 mm的球結(jié)膜表面，輕輕加壓，3～5 s之后撕下，然后于其左右相鄰的區(qū)域再各貼一張，φ=95％乙醇固定10～30 min，然后依次用0.5％高碘酸氧化，過碘酸希夫染色劑（periodic acid Schiff staining，PAS）染色，偏重亞硫酸漂洗，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹脂封片，置于雙目光學(xué)顯微鏡下觀察上皮細胞的連接，胞核胞漿的顏色，核漿比例（N/C），上皮細胞角化以及杯狀細胞密度。
　　
　　1.3.2  組織病理學(xué)檢查　　用藥4周取病變部位球結(jié)膜，生理鹽水沖洗干凈后放入10%甲醛固定液固定。流水沖洗固定組織過夜。依次進行乙醇梯度脫水，φ=70%乙醇15 s，80%、90%、95%、100%乙醇各3 h。二甲苯透明3次，每次10 min。從低熔點石蠟到高熔點石蠟浸蠟共3次，每次1 h。將浸蠟后的組織放入包埋盒內(nèi)，倒入熔化的高效切片石蠟，待凝固后取出石蠟塊。將石蠟塊安裝在切片機的組織固定架上用，調(diào)節(jié)切片厚度在4～6 μm每個石蠟塊切2～3張切片。
　　
　　1.3.3  免疫組織化學(xué)染色　　將組織片放入20 ℃溫水中展開，貼于玻片上，放入烘箱內(nèi)烘干5 min，依次放入二甲苯脫蠟和95%乙醇各2次，每次1 min。PBS（0.01 mol/L，PH 7.4）漂洗3 min × 3；4 ℃1% Tris?Triton 100通透5 min，用PBS漂洗3 min ×3；加20 μL即用型過氧化物酶阻斷劑于室溫下孵育10 min，用PBS漂洗3 min× 3，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；加20 μL非免疫動物血清于室溫孵育5 min，以減少非特異性背景染色；傾去血清吸去多余液體，滴加一抗（MUC5AC）于4 ℃孵育12 h，用PBS漂洗3 min×3；加20 μL生物素標記的二抗，于室溫下孵育10 min，用PBS漂洗3 min× 3；加20 μL辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素于室溫下孵育10 min，用PBS漂洗3 min ×3；加新鮮配制的DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察結(jié)果，1～2 min水洗終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染核15～30 min，染色過深者用鹽酸酒精漂洗；每一批實驗均設(shè)有陽性及空白對照，陽性對照：采用已知陽性的胃癌切片（由試劑公司提供）；空白對照：以PBS代替一抗。
　　
　　1.4  結(jié)果判定
　　
　　1.4.1  印跡結(jié)膜杯狀細胞觀測　　分級根據(jù)NELSON’s分級標準進行分級［３］：0級：結(jié)膜上皮細胞形態(tài)正常，層次大小一致，胞漿藍綠色，N/C為1∶2，杯狀細胞密集分布；1級：結(jié)膜上皮細胞輕度擴大，胞漿藍綠色，N/C為1∶3，杯狀細胞開始減少密度下降；2級：所有結(jié)膜上皮細胞均擴大，變扁平，胞漿藍綠色或粉紅色，N/C為1∶4 或1∶5，輕度角化。杯狀細胞明顯減少；3級：結(jié)膜上皮細胞漿內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)，核固縮崩解，上皮細胞胞漿呈粉紅色，N/C為1∶6或1∶8，出現(xiàn)不同程度的角化，杯狀細胞完全喪失，視野下不見杯狀細胞。　　結(jié)膜杯狀細胞計數(shù)方法：計算每個動物所取3張標本中共10個高倍鏡（400×）下杯狀細胞數(shù)目總數(shù)的平均值。
　　
　　1.4.2  MUC5AC陽性細胞檢測　　MUC5AC陽性細胞內(nèi)有棕黃色顆粒，隨機統(tǒng)計100個結(jié)膜上皮細胞中陽性細胞數(shù)。
　　
　　1.4.3  結(jié)膜炎性細胞浸潤程度判定　　蘇木素復(fù)染核顯示炎性細胞胞核，以每高倍視野下炎性細胞數(shù)目來判定結(jié)膜結(jié)締組織中炎性細胞的浸潤密度。
　　
　　1.5  統(tǒng)計學(xué)處理　　應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析（one?way ANOVA） 及均數(shù)多重比較檢驗分析觀察期各指標的變化及組間各指標平均值的差異，以P<0.05為差異有顯著性。
　　
　　2  結(jié)果
　　
　　用藥4周后，對照組結(jié)膜杯狀細胞為2級，安賀拉組為1級；對照組結(jié)膜炎性細胞浸潤密度高于安賀拉組，杯狀細胞密度、MUC5AC陽性細胞率均小于安賀拉組（見表1，圖1，圖2）。
　　
　　表1   兩組結(jié)膜病理學(xué)檢測指標比較（略）
　　
　　Tab.1  Comparison of pathologic changes in conjunctiva between two groups
　　
　　與對照組比較：*P<0.05;**P<0.01
　　
　　圖1  安賀拉組結(jié)膜杯狀細胞MUC5AC免疫組織化學(xué)染色（×200）（略）
　　
　　Fig. 1   MUC5AC immunohistochemical staining of goblet cell in the group treated with ketorolac trometh?mine(×200)
　　
　　圖2  對照組結(jié)膜杯狀細胞MUC5AC免疫組織化學(xué)染色（×200）（略）
　　
　　Fig. 2  MUC5AC immunohistochemical staining of goblet cell in the control group (×200)
　　
　　3  討論
　　
　　干眼癥患者因杯狀細胞減少，不能不斷地產(chǎn)生和分泌黏液，使結(jié)膜囊保持的潤滑度下降，眼瞼與眼球間活動的摩擦力升高，淚膜的更新和穩(wěn)定下降，無法維持結(jié)膜和角膜的生理性潮濕和潤澤，從而出現(xiàn)一系列眼部不適的癥狀和體征。長期在空調(diào)開放、空氣不流通的環(huán)境里工作或經(jīng)常從事注意力集中的工作或活動，如長時間使用電腦，在熒光屏前工作、閱讀的人容易引起干眼癥。
　　
　　研究表明，所有類型的干眼均與炎癥有關(guān)［４］。干眼所促發(fā)的是一類非感染性、免疫相關(guān)性的炎癥反應(yīng)，是在各種致炎因素的刺激下，眼局部出現(xiàn)的防疫性反應(yīng)［５］。安賀拉是一種新型非甾體抗炎藥，其通過抑制環(huán)氧化酶而阻斷花生四烯酸來抑制前列腺素的合成；穩(wěn)定肥大細胞，抑制組織胺、前列腺素等化學(xué)介質(zhì)的釋放；阻斷炎性介質(zhì)對眼部的刺激和損害，發(fā)揮較強的抗炎作用。本研究應(yīng)用安賀拉滴眼液治療兔干眼模型，研究其療效及可能的作用機制。
　　
　　淚膜由外至內(nèi)分為3 層：脂質(zhì)層、水液層和黏蛋白層。黏蛋白層對于淚膜的形成起著至關(guān)重要的作用。黏蛋白有極強的親水性，它主要的功能是覆蓋角膜上皮，從而賦予了角膜的可濕潤性。眼表的黏蛋白包括角結(jié)膜上皮分泌的跨膜蛋白MUC?1、2、4，杯狀細胞上皮分泌的分泌型蛋白質(zhì)MUC?5，以及由淚腺分泌的水溶型分泌性蛋白MUC7。MUC5AC是構(gòu)成淚膜黏蛋白層的最主要成份。這些黏蛋白，尤其是MUC5AC ,被認為對于促進淚膜在眼表的分布、維持淚膜的穩(wěn)定性至關(guān)重要［6］。本研究結(jié)果顯示，用藥4周后，安賀拉組MUC5AC陽性細胞數(shù)明顯多于對照組，且其炎性細胞浸潤程度遠遠小于對照組。
　　
　　印跡細胞學(xué)檢查是一種簡便易行、無創(chuàng)傷、可重復(fù)性好的眼表細胞學(xué)檢查方法，間接反映杯狀細胞的分布和數(shù)量。通過印跡細胞學(xué)檢查，用藥4周后，安賀拉組結(jié)膜上皮細胞輕度擴大， N/C為1∶3，杯狀細胞為1級；而對照組結(jié)膜上皮細胞擴大變扁平， N/C為1∶4 或1∶5，輕度角化，杯狀細胞為2級；安賀拉組杯狀細胞密度也大于對照組。
　　
　　綜上所述，安賀拉滴眼液可減輕眼表的炎癥反應(yīng)，在干眼的治療方面具有一定的應(yīng)用前景。本研究結(jié)果提示安賀拉滴眼液可能對杯狀細胞有作用。但這種作用是安賀拉滴眼液本身促進杯狀細胞增殖，還是因為眼局部炎癥反應(yīng)減輕，改善細胞外環(huán)境而使杯狀細胞增殖，有待于進一步研究探索。

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