5種中草藥提取物對致病性弧菌的抑菌作用研究論文

　　目的 研究5種中草藥對致病弧菌的抑菌活性，為水產(chǎn)品的安全用藥提供參考。方法 采用紙片法和試管法，以溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)、塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鯊魚弧菌 (Vibrio carchariae)為供試菌株，測定中草藥不同極性萃取部分的抑菌圈和最小抑菌濃度。 結果 夾竹桃葉、芒果葉、苦楝葉和羊蹄甲葉4種中草藥乙酸乙酯萃取部分對供試弧菌有很好的抑菌作用；苦楝葉和羊蹄甲葉石油醚萃取部分對副溶血弧菌有抑菌作用；芒果葉的水溶性部分對塔氏弧菌有很強的抑菌作用；枇杷葉提取物對4株弧菌均無抑制作用。結論 除枇杷葉外，其他4種中草藥可不同程度的抑制致病弧菌的生長，其抑制致病弧菌的活性成分有待于進一步研究。
　　
　　Abstract:Objective To study the anti?bacteria activities of five herbs, to provide references for the safe drugs of aquaculture. Methods  Using Vibrio coralliilyticus, Vibrio tubiashii, Vibrio parahaemolyticus and Vibrio carchariae as the tested bacteria, the inhibition zone and the minimal inhibitory concentration（MIC）were measured. Results  The extracts, extracted with ethyl acetate from the leaves of Nerium indicum Mill, Mangifera indica Linn, Melia azedarach L. and Bauhinia purpurea could inhibit vibrio. And the extracts, extrated with petroleum ether from leaves of Melia azedarach L. and Bauhinia purpurea can inhibit Vibrio parahaemolyticus, too. The remainder extracts of Mangifera indica Linn.showed strong inhibition effect on Vibrio tubiashii. While the extracts of Eriobotrya japonica showed no inhibition effect. Conclusion  Four of the five herbs show anti?bacteria activities and the study on active compounds should be done in future.
　　
　　Key words:herb；Vibrio；anti?bacteria activity；minimal inhibitory concentration
　　
　　隨著現(xiàn)代集約化和規(guī)模化水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展，養(yǎng)殖中水產(chǎn)動物感染細菌的幾率大大增加。為了預防水產(chǎn)動物疾病，大量抗生素類藥物被用作水產(chǎn)藥物。濫用抗生素使致病菌的耐藥性增加，藥物的有效性降低，同時也加劇了環(huán)境污染，殘留藥物降低了水產(chǎn)成品的品質，引發(fā)了市場對水產(chǎn)品安全性的質疑，降低了水產(chǎn)商品在國際貿易中的競爭力。因此，開發(fā)替代抗生素的高性能、無毒副作用、安全高效的抑菌藥物引起了廣大科研人員的關注。
　　
　　本研究以夾竹桃（Nerium indicum Mill）、芒果（Mangifera indica Linn.）、苦楝（Melia azedarach L.）、羊蹄甲（Bauhinia purpurea）和枇杷（Eriobotrya japonica）等5種中草藥為研究對象，選取對水產(chǎn)品危害較大的4株致病弧菌為實驗菌株，旨在通過抑菌活性的篩選研究，獲得安全有效的天然抑菌藥物。
　　
　　1  材料與方法
　　
　　1. 1  儀器及試劑
　　
　　主要儀器有DFT?200型搖擺式高速中藥粉碎機（溫嶺市大德中藥機械有限公司）、RE52CS型旋轉蒸發(fā)器（上海亞星生化儀器廠）、LDZX40CI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）、150A生化培養(yǎng)箱（金壇市迅生儀器廠）、SW?CJ?1D型潔凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設備有限公司）。所用試劑均為分析純。使用的培養(yǎng)基為2216E培養(yǎng)基。環(huán)丙沙星紙片為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。
　　
　　供試菌種：溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)、塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鯊魚弧菌 (Vibrio carchariae)由南海水產(chǎn)研究所提供。
　　
　　1. 2  供試藥材及預處理
　　
　　供試藥材為廣東常見的5種植物的葉，供試的5種植物分別是夾竹桃（Nerium indicum Mill）、芒果（Mangifera indica Linn.）、苦楝（Melia azedarach L.）、羊蹄甲（Bauhinia purpurea）、枇杷（Eriobotrya japonica）。5種供試植物均采自廣東藥學院藥用植物園，原植物均經(jīng)藥用植物教研室嚴寒靜副教授鑒定。供試植物葉片陰干后粉碎成粗粉備用。取供試藥材粗粉各20 g，用60%（φ）乙醇回流提取90 min后濾過，濾液減壓濃縮至50 mL后，依次用等體積石油醚、乙酸乙酯萃取。將3種萃取液分別減壓濃縮至1 g/mL（以生藥計），即得石油醚萃取部分（Ⅰ）、乙酸乙酯萃取部分（Ⅱ）和水溶部分（Ⅲ）。
　　
　　1. 3  病原菌的分離和菌懸液制備［1］
　　
　　將4株供試菌分別劃線接種于平皿培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)24 h后，挑選單個菌落轉接于斜面培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h后，用2 mL 0.9% NaCl溶液進行洗脫即制得所需菌懸液。
　　
　　1.4  紙片法抑菌試驗
　　
　　按無菌操作規(guī)程［2］，吸取4株供試菌懸液各0.1 mL，分別加到平板培養(yǎng)基上并涂布均勻。將預先滅菌烘干并浸蘸定量藥液的濾紙片（直徑為5 mm）平貼在含菌培養(yǎng)基上。同時用浸有相應溶劑的濾紙片做對照。每份樣品做3份，結果取平均值。28 ℃倒置培養(yǎng)，并于12 h和24 h觀察抑菌效果，測定抑菌圈的直徑。以環(huán)丙沙星為陽性對照。
　　
　　1.5  試管稀釋法測最低抑菌濃度
　　
　　采用試管稀釋法，以相應溶劑作對照，測定有抑菌活性的藥液的最低抑菌濃度(MIC)。每種提取物為一組，每組取無菌試管12支，于第1管中加入1.0 mL濃度為2×105 CFU(colony forming units)/mL的菌液，在2～10管中每管加入1.0 mL 濃度為1×105 CFU/mL菌液，在第1管內加入中藥濃縮液1.0 mL，充分混勻后取1.0 mL放入第2管，混勻后再取1.0 mL放入第3管，第1管內的藥物濃度為原液的1/2，第2管為第1管的1/2，其余類推，直至第10管，每種藥物的第11管作菌液對照（僅加菌液不加中藥），第12管作藥物對照（僅加中藥不加菌液），以能抑制細菌生長（培養(yǎng)后培養(yǎng)基仍清亮）的最小藥物濃度為其MIC。
　　
　　2  結果與分析
　　
　　2.1  紙片法抑菌試驗結果
　　
　　見表1。由表1數(shù)據(jù)可知，陽性對照環(huán)丙沙星對4株菌均有抑制作用，而中草藥提取物只對溶珊瑚弧菌、副溶血弧菌和塔氏弧菌3株菌產(chǎn)生抑制作用。其中，夾竹桃葉、苦楝葉和羊蹄甲葉對副溶血弧菌和溶珊瑚弧菌有抑制作用；芒果葉對溶珊瑚弧菌和塔氏弧菌有抑制作用；枇杷葉對4株供試致病菌均無抑制作用。比較不同提取部位抑菌作用可知，乙酸乙酯提取部分的抑菌活性較明顯，苦楝葉、芒果葉、夾竹桃葉和羊蹄甲葉乙酸乙酯萃取部分均產(chǎn)生抑菌圈；石油醚萃取部分的抑菌結果顯示，苦楝葉、羊蹄甲葉石油醚提取部分能產(chǎn)生抑菌圈；水溶性部分只有芒果葉產(chǎn)生抑菌圈。分析不同供試菌敏感性發(fā)現(xiàn)，副溶血弧菌和溶珊瑚弧菌兩株供試菌對夾竹桃葉、苦楝葉和羊蹄甲葉提取物均敏感，能產(chǎn)生不同大小的抑菌圈；塔氏弧菌只對芒果葉的水溶性部分敏感；鯊魚弧菌對中草藥提取物則完全不敏感。表1  5種植物不同萃取部分的抑菌圈（略）注：石油醚萃取部分簡稱為I,乙酸乙酯萃取部分簡稱II,水溶部分簡稱III。
　　
　　2.2  試管稀釋法測定最低抑菌濃度結果
　　
　　見表2。由MIC數(shù)據(jù)可知，芒果葉提取物對溶珊瑚弧菌和塔氏弧菌的MIC最低，表明芒果葉提取物在質量濃度為12.5 mg/mL（以生藥計）時即可完全抑制兩菌的生長�？�楝葉和羊蹄甲提取物對溶珊瑚弧菌和副溶血弧菌的MIC均為50.0 mg/mL（以生藥計），夾竹桃對溶珊瑚弧菌和副溶血弧菌的MIC為25.0 mg/mL（以生藥計）。其他組分的MIC均大于200 mg/mL。表2  5種植物不同萃取部分的最小抑菌濃度（略）注：“+”表示MIC＞200 mg/mL
　　
　　3  討 論
　　
　　弧菌（Vibrio）因菌體有一個弧狀彎曲而得名，廣泛分布于自然界中，水環(huán)境中較多，對人、魚、蛙及其他動物均有致病性，其中霍亂弧菌和副溶血弧菌是引起人類細菌性食物中毒的首要食源性致病菌。目前，從海水、淡水和養(yǎng)殖水體中分離鑒定出弧菌（Vibrio）共有100多種，其中多數(shù)是致病菌，嚴重危害人類的食品安全。本研究所用供試菌鯊魚弧菌和副溶血弧菌也是《美國臨床微生物手冊》記載的人類致病菌。通過研究發(fā)現(xiàn)，鯊魚弧菌對5種中草藥均不敏感，而其他3種致病弧菌均有敏感中草藥，說明該菌具有對抗普通抑菌藥物的生長機制，應對其機理展開進一步的研究。
　　
　　本研究所選5種中草藥是我國嶺南地區(qū)資源豐富、廣泛易得的藥材。本研究結果表明，除枇杷葉外，其他4種均有抑制致病弧菌的作用。比較文獻結果發(fā)現(xiàn)，夾竹桃粗提物對大腸桿菌、糞腸球菌等的MIC為0.5 g/mL［3］，本研究結果表明夾竹桃乙酸乙酯萃取物對溶珊瑚弧菌和副溶血弧菌的MIC僅為25mg/mL。MIC結果差異的產(chǎn)生可能與以下2個因素有關：①菌種不同，敏感性不同。本研究采用的是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的致病弧菌，而文獻所用供試菌為桿菌和球菌；②藥材的提取方法不同，本研究采用粗提后再萃取的方法處理藥材，一定程度上精制了樣品，去除了干擾，而文獻中藥物的處理方法僅為水提處理。本研究中，芒果葉的乙酸乙酯萃取物和水溶性部分分別對溶珊瑚弧菌和塔氏弧菌有較好的抑菌作用，說明萃取法可以有效地將不同活性的成分分開，比較文獻所用的水煎煮法［4］，萃取法的優(yōu)勢在于將不同極性的成分進行了粗分，為進一步研究活性成分提供了依據(jù)。實驗結果表明，苦楝葉和羊蹄甲葉分別對溶珊瑚弧菌和副溶血弧菌具有較好抑菌作用，苦楝葉的抑菌功效與其清熱燥濕的作用相符合，而羊蹄甲根的抗菌活性成分已被分離獲得［5］。
　　
　　此外，本研究采用環(huán)丙沙星為陽性對照藥，實驗發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星對4株弧菌有廣泛且明顯的抑菌作用，說明該4株菌對環(huán)丙沙星較敏感且沒有產(chǎn)生耐藥性。雖然環(huán)丙沙星對4株弧菌的抑菌作用優(yōu)于中草藥提取物，但由于其成分和作用機理單一，臨床上已有耐藥菌出現(xiàn)。因此，不宜在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中長期用藥。相比之下，中草藥提取物由于成分復雜，作用機理不統(tǒng)一，較難產(chǎn)生耐藥菌，有較高的實際應用價值，有必要進一步開發(fā)。

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