- 相關(guān)推薦
多酚氧化酶的研究現(xiàn)狀
論文摘要：多酚氧化酶被認(rèn)為是導(dǎo)致酶促褐變反應(yīng)的主要因素，對(duì)其的研究也在逐步深入。文章結(jié)合多酚氧化酶的結(jié)構(gòu)特性、催化機(jī)理、活性影響因素、生理功能、活性測定和分離純化等方面的內(nèi)容，對(duì)多酚氧化酶的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述。
論文關(guān)鍵詞：多酚氧化酶(PPO);催化機(jī)理;生理功能
多酚氧化酶 (polyphenol oxidase，PPO)屬核編碼含銅金屬酶，廣泛存在于植物、真菌、昆蟲等機(jī)體中。它可分為酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶、漆酶等三大類，由于其能有效催化多酚類化合物氧化形成相應(yīng)的醌類物質(zhì)，因此被認(rèn)為是導(dǎo)致酶促褐變反應(yīng)的主要因素。早在1937年Kubowitz就在Warburg實(shí)驗(yàn)室中第一次分離得到了多酚氧化酶[2，3]。隨著研究的不斷深入，對(duì)多酚氧化酶各方面的認(rèn)識(shí)也在不斷加深，本文就多酚氧化酶的結(jié)構(gòu)特性、催化機(jī)理、生理作用等方面做簡要的介紹。
一、多酚氧化酶PPO的結(jié)構(gòu)特性
PPO是一種含有Cu2+離子的結(jié)構(gòu)蛋白，可以催化酚類上的羥基，使之轉(zhuǎn)化為醌或催化多酚類變?yōu)檠鹾?a target="_blank" title="醌">醌。因?yàn)?a target="_blank" title="醌">醌類具有較強(qiáng)的電化學(xué)性質(zhì)，會(huì)發(fā)生自動(dòng)氧化、蛋白質(zhì)的親核聚合反應(yīng)及一些二級(jí)反應(yīng)，而這些反應(yīng)都會(huì)導(dǎo)致酶促褐變反應(yīng)的發(fā)生。植物中的PPO包括一些由核編碼的，多基因的家族。在蕃茄中，已有幾個(gè)PPO的基因被分離出來，并從結(jié)構(gòu)上將其分為三組。在馬鈴薯中，有4條獨(dú)立的cDNA被克隆，每一個(gè)都顯示了獨(dú)特的空間圖景。在扁豆中，有三條與PPO有關(guān)的cDNA克隆已被建立。所有的PPO基因都有兩個(gè)區(qū)域，一是與Cu有關(guān)的編碼區(qū)，另一個(gè)是引導(dǎo)肽(transitpeptide)，以便能進(jìn)入質(zhì)體。PPO的前體(含有引導(dǎo)肽的)約60-75KDa，而成熟的PPO(去除了引導(dǎo)肽的有活性的形式)約45-69 KDa，由于這種潛在的酶活性的存在，使PPO活性的問題研究起來十分復(fù)雜。未激活的PPO可被陳化作用、加鹽、去污劑(如SDS)、蛋白酶切或尿素的加入等激活。
二、PPO的催化機(jī)理
多酚氧化酶(PolyphenolOxidase，PPO)是從真菌到植物乃至哺乳動(dòng)物體內(nèi)都廣泛存在的一類銅蛋白，它能有效催化多酚類化合物氧化形成相應(yīng)的醒類物質(zhì)。在茶兒茶素氧化PPO底物兒茶素(catechin)類能和許多金屬離子絡(luò)合，Cu2+離子形成的配位物中的配位數(shù)為4或6，可以從配位體的配位鍵來闡明PPO的催化生化機(jī)理。PPO的多肽鏈通過自身的折疊卷曲，形成具有一定構(gòu)象的高級(jí)結(jié)構(gòu)。Cu2+與多肽鏈上的氨基酸殘基以配位鍵相連，主要有His-His和Cys-His殘基作為銅離子的配基，形成具有特定立體結(jié)構(gòu)的活性部位。當(dāng)鄰苯二酚基和底物存在時(shí)，由于其“靠近”及“定向”效應(yīng)，使多肽鏈和底物的空間構(gòu)象發(fā)生改變，相互契合，從而使底物進(jìn)入活性中心，鄰苯二酚基上的二個(gè)羥基與多肽鏈上的氨基酸殘基以氫鍵相連，形成酶與底物的復(fù)合物，由于復(fù)合物的不穩(wěn)定性，多肽鏈構(gòu)象發(fā)生扭曲，氫鍵斷裂，H被附著在多肽鏈上，酶與底物不再契合，兩者都同時(shí)發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，于是產(chǎn)物脫離了活性部位，成為鄰醌。鄰醌可發(fā)生一系列次生氧化作用，形成了多種氧化產(chǎn)物。酶又通過脫氫作用，發(fā)生構(gòu)象回轉(zhuǎn)，恢復(fù)以前的天然構(gòu)象，重新成為具有催化能力的蛋白質(zhì)。
三、PPO的生理功能
高等植物組織發(fā)生褐變主要是PPO活動(dòng)的結(jié)果。PPO催化單酚羥基化為鄰二酚，二羥酚氧化為鄰醌。醌聚合并與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基酸反應(yīng)，結(jié)果發(fā)生黑色或褐色色素沉淀，最終導(dǎo)致水果、蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物營養(yǎng)丟失和經(jīng)濟(jì)損失。
PPO作為一種氧化還原酶還在光合作用中發(fā)揮作用。如調(diào)節(jié)葉綠體中有害的光氧化反應(yīng)速度，參與其中電子傳遞;PPO還可促進(jìn)傷口的愈合，也可增加植物對(duì)病原體的抗性。如煙草對(duì)炭疽病、黃瓜對(duì)黑星病、蘋果對(duì)輪紋病、棉苗對(duì)枯萎病菌、水稻對(duì)白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病以及番茄對(duì)小昆蟲的抗性等。PPO的作用方式有：
1.如番茄的具腺毛狀體中含有大量PPO，PPO具有存在于表皮中、活化態(tài)和可溶性的特性，在毛狀體介導(dǎo)的抗病過程中起作用[12]。
2.通過醌共價(jià)調(diào)節(jié)親核氨基酸形成抗?fàn)I養(yǎng)機(jī)制，直接抵御昆蟲和病原體[13]。
3.醌的毒性直接發(fā)揮抗病作用。
4.如番茄中PPO克隆的反義表達(dá)可對(duì)基因家族的各成員進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)，對(duì)病原體產(chǎn)生超敏感性(感受性過敏)[14]。
5.鄰醌的次生反應(yīng)所產(chǎn)生的黑色素的痂可阻止感染的擴(kuò)散[15]。
PPO與水果和作物的褐變有關(guān)，為了防止水果褐變保持水果的新鮮性，生產(chǎn)上運(yùn)用多種方法來降低水果中的PPO含量，例如涂以抗壞血酸、檸檬酸為主劑的復(fù)合護(hù)色劑，杏用沸水燙4min基本控制PPO活性，對(duì)萊陽梨進(jìn)行套袋抑制PPO活性等。
四、PPO活性影響因素
隨著誘導(dǎo)劑特性的不同，PPO的分子特性如分子量、等電點(diǎn)等都有所改變。生長培養(yǎng)基的成分也可部分地控制PPO酶產(chǎn)量，例如：硫酸銨抑制PPO形成，而谷氨酸促進(jìn)PPO形成。在植物組織中激活劑可打破PPO的潛伏狀態(tài)。在蠶豆中PPO可被游離脂肪酸酸化激活，菠菜類囊體中分離出來的PPO可被亞麻酸激活。這表明PPO的天然激活劑確實(shí)存在。同樣PPO的天然抑制劑也存在，例如菠菜葉中的草酸鹽，茶葉中的橡黃素、白花青素等。礦物質(zhì)營養(yǎng)例如鈣或磷的缺乏可導(dǎo)致PPO活性的降低;硼缺乏對(duì)單子葉植物無影響，但可導(dǎo)致雙子葉植物中PPO活性的增加。植物正常新陳代謝受到干擾也會(huì)導(dǎo)致PPO活性的改變：例如貯存時(shí)通風(fēng)不好或生長時(shí)水分不夠均可引起PPO水平的升高。銅是PPO的組成部分，銅缺失時(shí)苜蓿葉片不能表現(xiàn)出PPO酶活性，即使后來再補(bǔ)充銅也不行，這說明全酶只能在發(fā)育的早期形成。
鐘瑾等[16]用自制殼聚糖與戊二醛交聯(lián)對(duì)PPO固定化進(jìn)行了初步探討，表明當(dāng)戊二醛濃度為2%時(shí)，酶活力最高，并提出在確定給酶量時(shí)，要兼顧酶活和回收率二者的影響以達(dá)到最佳。李榮林等[17]應(yīng)用海藻酸鈉和戊二醛交聯(lián)法對(duì)PPO進(jìn)行包埋取得了成功，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)[18]：將酶的最適pH上移至7.0，最適溫度上升至40℃，酶對(duì)金屬離子的適應(yīng)性增強(qiáng)，對(duì)抑制劑敏感性下降，低溫貯存下，半衰期由3個(gè)月上升到221天。
五、PPO活性的測定方法
測定多酚氧化酶活性的方法有：檢壓法、極譜電極法、比色法、碘量滴定法等[19]。最早是將酚或鄰苯二酚作為底物用滴定法來測定多酚氧化酶活性，后來發(fā)現(xiàn)用極譜電極法測定O2消耗更精確一些[20]。但是，無論是滴定法還是極譜電極法都必須經(jīng)過種子研磨的過程，為了測定的省時(shí)方便， Kruger[21]首創(chuàng)了無須研磨種子就可以測出小麥多酚氧化酶活性的方法:種子在水中浸泡16h，然后加入鄰苯二酚，反應(yīng)30min后用動(dòng)態(tài)的微盤計(jì)數(shù)器測溶液的顏色變化。將這種方法與研磨種子氧電極法比較，相關(guān)系數(shù)為0. 85。伴隨著科技的發(fā)展和分光光度計(jì)的應(yīng)用， Anderson[22]將整粒種子測定方法做了進(jìn)一步改進(jìn): 3～5個(gè)整籽�；�0.4g被鉗碎的種子放入離心管中，加入用50mM MOPS緩沖液配制的L-DO-PA，室溫振蕩反應(yīng)30min或37℃振搖5min后過濾，然后在分光光度計(jì)下測定475nm吸收值，這種方法與研磨種子氧電極法比較，相關(guān)系數(shù)為0.86。
六、PPO的分離純化
PPO通常以不溶狀態(tài)存在，為使其以可溶形式從完整細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)中釋放出來，并保持其活性和穩(wěn)定性，通常要進(jìn)行充分的細(xì)胞破碎，釋放出細(xì)胞的內(nèi)含物，經(jīng)勻漿提取后可得粗酶制劑。為了減少對(duì)細(xì)胞活動(dòng)的影響，需盡量去模擬細(xì)胞體內(nèi)的環(huán)境，如適宜的pH(5.6)、溫度(37℃)等。如茶葉中存在大量的多酚類物質(zhì)，因此在該酶的分離提純過程中要加入多酚吸附劑，如聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)等以清除多酚。
多酚氧化酶的分離提純方法有冷丙酮法和勻漿法二種方法。須海榮 [23]研究指出：冷丙酮法效果較差，酶活較低，可能跟丙酮引起酶蛋白不可逆變性有關(guān)，但其操作相對(duì)而言較為方便。隨著酶提取技術(shù)的發(fā)展，勻漿法逐步得以完善，首先它在酶的提取過程中能最大限度地保留酶的活性，其次能去除多酚氧化酶提取中的一些雜蛋白以及過氧化物酶等一些酶蛋白的影響。再采取硫酸銨分級(jí)沉淀，凝膠色譜等技術(shù)，以達(dá)到純化目的。
七、應(yīng)用前景
調(diào)節(jié)PPO表達(dá)是未來研究熱點(diǎn)，一方面因?yàn)槭軅蛩ダ蠒?huì)導(dǎo)致黑色素的形成，負(fù)調(diào)節(jié)PPO能大量提高作物的質(zhì)量;另一方面PPO的過度表達(dá)能減少害蟲對(duì)作物的侵害，或通過影響植物蛋白形成抗?fàn)I養(yǎng)機(jī)制，或在毛狀體滲出液中通過它啟動(dòng)聚合作用捕獲昆蟲。因此負(fù)調(diào)節(jié)PPO表達(dá)或調(diào)節(jié)PPO使其過度表達(dá)在生產(chǎn)及應(yīng)用方面都具有很好的前景及重要的實(shí)際意義。
參考文獻(xiàn)
BhattacharyaM, Luo Q, and Corke, H. Time-dependent changes in dough color in hexaploid wheat landraces differing inpolyphenol oxidasea-ctivity[J].J.Agric. Food Chem,1999,(47).
李榮林，方輝遂.一個(gè)世紀(jì)以來對(duì)多酚氧化酶研究的進(jìn)展[J].福建茶葉，1997，(4).
謝春艷，賓金華，陳兆平.多酚氧化酶及其生理功能[J].生物學(xué)通報(bào).1999，34(6).
Steffens, J.C.,Hare,l andHunt,M.D. Polyphenol oxidase. Pages in:Genetic Engineering of Plant Secondary Metabolism[J].Plenum Press:New york, 1994.
Whitaker, J.R., and Lee,C.Y. Recent advances in chemistry of enzymatic browning: an overview. Enzymatic browning and Its Prevention[J].C.Y.Lee and J.R.Whitaker, eds.ACS:washing,DC,1995.
Newman, S. D,Eannetta,N. T.,Yu,H., Prince, et al.Orgaanizaation of the tomato polyphenol oxidase gene family[J].Plant Mol.1992,(21).
Thygesen, P.W.,Dry, I.B., and Robinson, S. P. Polyphenol oxidase in Potato.A multigene family that exhibits differential expression patterns[J].PlantPhysio.l 1995,(109).
Cary,J.W.,Lax,A.R., and Flurkey,W.H. Cloning and characterization of cDNAs coding forVicia faba polyphenol oxidase[J].PlantMo.l Bio.l 1992,(20).
Okot-Kotber,M.A.,Liavoga,A.,Yong,K. J,et al. Activity and inhibition ofpolyphenoloxidase in extracts of bran and othermilling fractions from a variety ofwheat cultivars[J].CrealChem. 2001,(78).
孫淑聲，等.無機(jī)化學(xué)[M].北京：北京大學(xué)出版社，1991.
賀立紅.高等植物中的多酚氧化酶[J].植物生理學(xué)通訊，2001，37(4).
[12]Yu H, Kowalski S P,Steffens J C .Comparison of polyphenol oxidase expressioning and dular trichomes of solanum and lycopersicon species[J].Plant Physiol,1992,100(4).
[13] Duffey S,Felton G .Enzymatic antinutritive defenses of the tomato plant against insects .In Hedin P(ed) .Natutally Ocurring Pest Bioregulators.Washington D C .American chemical Society ,1991.
[14]Thipyapong P ,Joel D M ,Steffens J C .Differential expression and turn over of the tomato polyphenol oxidase gene family during vegetative and reproductive development[J].Plant Physiol,1997,13(3).
[15] ZawistowskiJ,Biliaderis CG,Eskin NAM. polyphenol oxidase. In:Robinson DS, Skin NAME (eds). Oxidative Enzymes in Foods.London: Elsevier Science Publishers,1991.
[16]鐘瑾，蕭偉祥，蕭慧.紅茶色素形成機(jī)理和制取[J].茶葉科學(xué)，1997，17(1).
[17]李榮林，等.多酚氧化酶固定化技術(shù)[J].茶葉科學(xué) ，1997，17(S1).
[18]李榮林.固定化多酚氧化酶的化學(xué)性質(zhì)研究[J].茶葉，1998，24(1).
[19]王守生.茶樹多酚氧化酶活性比色測定中抑制劑的選擇和應(yīng)用[J].茶葉通訊，1996，(1).
[20]Wrigley, C. W. Single-seed identification ofwheat varieties: use of grain hardness testing, electrophoretic analysis and a rapid testpaper for phenol reaction[J]. Sc.i Food Agric. 1976,(27).
[21]Kruger, J.E. Changes in the polyphenol oxidases ofwheatduring kernel growth andmaturation[J].erealChem. 1976,(53).
[22]Anderson, J.V. and C.F.Morris.An improved whole-seed assay for screen-ingwheatgermplasm for polyphenol oxidase activity[J].Crop Sc.i 2001,(41).
[23]須海榮.浙江12個(gè)茶樹良種酯酶同工酶譜聚類分析[J].茶葉科學(xué)，1988，8(2).
【多酚氧化酶的研究現(xiàn)狀】相關(guān)文章：
女研究生心理現(xiàn)狀研究論文10-08
可降解塑料的研究現(xiàn)狀09-30
我國電力經(jīng)濟(jì)現(xiàn)狀研究論文10-09
現(xiàn)代物流產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀研究10-05
農(nóng)村教育現(xiàn)狀研究報(bào)告10-07