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流式細胞術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進展
流式細胞術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進展【1】
【摘要】 流式細胞術(shù)(FCM)是一種對單細胞快速定量分析的新技術(shù),能夠快速分析單個細胞的多種特性，其既可以定性也可以定量，適于大量樣品的檢測。
隨著流式細胞分析技術(shù)與方法的日臻完善和臨床應(yīng)用范圍不斷拓寬，幾乎臨床醫(yī)學(xué)各學(xué)科都涉及到流式細胞分析技術(shù)的應(yīng)用，已逐漸成為推動臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要手段,本文就流式細胞術(shù)在臨床上的應(yīng)用進展作一綜述。
【關(guān)鍵詞】流式細胞術(shù);臨床;進展
流式細胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的對單細胞定量分析的一種新技術(shù)。
它借鑒了熒光標(biāo)記技術(shù)、激光技術(shù)、單抗技術(shù)和計算機技術(shù),具有極高的檢測速度與統(tǒng)計精確性,而且從單一細胞可以測得多個參數(shù),為生物醫(yī)學(xué)與臨床檢驗提供了全新視角和強有力手段[1]。
目前,隨著單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展,流式細胞儀檢測技術(shù)已經(jīng)廣泛使用在基礎(chǔ)研究和臨床實踐的各個方面,發(fā)揮著重要作用。
本文就其在臨床上的應(yīng)用綜述如下。
1 流式細胞術(shù)在免疫學(xué)中的應(yīng)用�
FCM可以進行淋巴細胞亞群分析,可同時檢測出一種或幾種淋巴細胞表面亞群分析,將不同的淋巴細胞亞群區(qū)分開來,并計算出它們相互間的比例。
通過對患者淋巴細胞各亞群數(shù)量的測定了解淋巴細胞的分化功能,鑒別新的淋巴細胞亞群。
更重要的是通過研究大多數(shù)疾病的特異性淋巴細胞亞群或某些細胞表面標(biāo)志的存在、缺乏、過度表達等,對一些疾病,如免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤等診斷、治療、免疫功能重建和器官移植監(jiān)測等有重要的臨床意義。
如HIV主要侵襲CD4+T細胞而導(dǎo)致CD4淋巴細胞減少,CD4/CD8淋巴細胞比值下降,為艾滋病的診斷和治療提供依據(jù)[2]。
在其它免疫功能性疾病的診治方面如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者的淋巴細胞變化可反映該病的活動情況和器官侵犯程度,伴有嚴(yán)重腎臟損害的SLE患者可出現(xiàn)低CD4+、高CD8+的現(xiàn)象[3]。
此外,FCM可以用來進行組織相容性抗原(HLA)群體分析;HLA-B27抗原陽性與強直性脊柱炎等一系列關(guān)節(jié)病有著不同程度的正相關(guān)。
FCM應(yīng)用HLA-B27特異性單抗檢測抗原，其敏感性較傳統(tǒng)的微量細胞毒性實驗大大提高,同時多參數(shù)的熒光測定使我們能夠在特定的細胞亞群中分析HLA-B27[4-5],還可以利用FCM進行移植配型移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測。
2 流式細胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用�
血液系統(tǒng)腫瘤的診斷和治療 FCM通過對外周血細胞或骨髓細胞表面抗原和DNA的檢測分析，對白血病、淋巴瘤等各種血液病的診斷、預(yù)后判斷和治療起著舉足輕重的作用。
FCM采用各種抗血細胞表面分化抗原的單克隆抗體，借助于各種熒光染料測定一個細胞的多種參數(shù)，以正確地判斷出該細胞的屬性。
各種血細胞系統(tǒng)都具有其獨特的抗原，當(dāng)形態(tài)學(xué)檢查難以區(qū)別時，免疫表型參數(shù)對各種急性白血病、淋巴瘤的診斷和鑒別診斷有決定性作用，其診斷的準(zhǔn)確性可達到90%左右[5]。
微小殘留病變(MRD)是白血病復(fù)發(fā)的主要根源,FCM能在患者緩解期檢測是否有殘留病變細胞，及早發(fā)現(xiàn)后采取措施避免復(fù)發(fā)。
而且測定 DNA倍體和進行細胞周期分析對指導(dǎo)白血病化療也有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不 同病期白血病細胞增殖狀況不同，定期了解細胞增殖情況采取相應(yīng)藥物可以提高療效。
急性白血病的多耐藥基因(MDR)也常用FCM檢測，F(xiàn)CM特有的敏感性和特異性，用于檢測二氨基苯茚酮 mRNA的表達產(chǎn)物 P糖蛋白(Pgp)及其活性(作為藥物的排出泵，降低細胞內(nèi)藥物濃度)，可以更直接的反映耐藥程度。
陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)是一種造血干細胞克隆病,細胞 CD55、CD59抗原表達減低是該病的一個特點。
FCM采用熒光標(biāo)記的單克隆抗體對血細胞 CD59的表達做定量分析，可以協(xié)助臨床做出診斷并判斷疾病的嚴(yán)重程度。
網(wǎng)織紅細胞計數(shù)是反映骨髓造血功能的重要指標(biāo)。
FCM通過某些熒光染料(吖啶橙等)與紅細胞中 RNA結(jié)合，定量測定網(wǎng)織紅細胞中 RNA，得到網(wǎng)織紅細胞占成熟紅細胞的百分比。
有報道認為[6]FCM比目測法的精確度更高。
此外，F(xiàn)CM還可以測量出網(wǎng)織紅細胞的成熟度，對紅細胞增殖能力的判斷很有意義，為干細胞移植術(shù)后恢復(fù)的判斷、貧血的治療監(jiān)測、腫瘤患者放、化療對骨髓的抑制狀況等提供了依據(jù)。
造血干/祖細胞計數(shù)造血干/祖細胞具有自我復(fù)制和多向分化潛能，是各種血細胞和免疫細胞的始祖。
造血干/祖細胞計數(shù)對造血干細胞移植意義重大。
CD34抗原是早期造血干/祖細胞的表面標(biāo)志，應(yīng)用 FCM分析、計數(shù) CD34 細胞已成為造血干/祖細胞移植、造血重建的重要指標(biāo)。
由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白的表達水平的高低來判斷,FCM測定血小板膜糖蛋白的表達情況可以診斷血小板膜糖蛋白異常所致疾病,這類疾病很少見但病因明確,主要是GpⅡb/Ⅲa或GpⅠb/Ⅸ/Ⅴ缺陷所致。
患者血小板膜GpⅡb/Ⅲa的缺乏,導(dǎo)致血小板聚集功能明顯低下,這就是常染色體隱性遺傳病-血小板無力癥。
而巨血小板綜合征是由于GpⅠb/Ⅸ/Ⅴ復(fù)合物數(shù)量或質(zhì)量的缺陷導(dǎo)致的遺傳性出血性疾病。
FCM還可以通過單抗免疫熒光標(biāo)記血小板膜糖蛋白監(jiān)測血小板功能及活化情況,評價活化血小板程度在血栓性疾病和血栓前狀態(tài)發(fā)生發(fā)展中的作用,有利于血栓栓塞性疾病的診斷和治療,此外血小板活化時細胞內(nèi)的鈣離子濃度是活化血小板監(jiān)測的一項非免疫性指標(biāo),免疫性血小板減少性紫癜患者血漿中可產(chǎn)生血小板自身抗體,結(jié)合在血小板表面,稱為血小板相關(guān)抗體,檢測血小板表面或血清中的相關(guān)抗體,可用于該病的診斷及治療監(jiān)測[7]。
3 流式細胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用�
FCM在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用主要是利用DNA含量測定進行包括癌前病變及早期癌變的檢出、化療指導(dǎo)以及預(yù)后評估等工作,FCM可精確定量DNA含量,能對癌前病變的性質(zhì)和發(fā)展趨勢做出判斷,有助于癌變的早期診斷[6]。
首先需要把實體瘤組織解聚、分散制備成單細胞懸液,用熒光染料(碘化吡啶P1)染色后對細胞的DNA含量進行分析,將不易區(qū)分的群體細胞分成三個亞群(G期、S期、G2期),DNA含量直接代表細胞的倍體狀態(tài),非倍體細胞與腫瘤惡性程度有關(guān)。
DNA非整倍體細胞峰存在可為腫瘤診斷提供有力依據(jù)[6]。
腫瘤細胞DNA倍體分析對患者預(yù)后的判斷亦有重要作用。
異倍體腫瘤惡性病變的復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率及死亡率均較高,而二倍體及近二倍體腫瘤的預(yù)后則較好。
FCM不僅可以對惡性腫瘤DNA含量進行分析,還可根據(jù)化療過程中腫瘤DNA分布直方圖的變化去評估療效,了解細胞動力學(xué)變化,對腫瘤化療具有重要的意義。
臨床醫(yī)師可以根據(jù)細胞周期各時相的分布情況,依據(jù)化療藥物對細胞動力學(xué)的干擾理論,設(shè)計最佳治療方案。
從DNA直方圖直接地看到腫瘤細胞的殺傷變化,及時選用有效的藥物對腫瘤細胞達到最大的殺傷效果。
4 流式細胞術(shù)在細胞凋亡和多藥耐藥基因中的應(yīng)用�
細胞凋亡是機體生長發(fā)育、細胞分化和病理狀態(tài)中細胞死亡的過程,凋亡典型的形態(tài)特征是核染色質(zhì)固縮并分離,細胞質(zhì)濃縮,細胞膜和核膜皺曲,核斷裂形成片斷,最后形成數(shù)量不等的凋亡小體。
FCM可以進行DNA含量分析,通過二倍體細胞G0/G1期峰前的亞二倍體峰來確定。
在凋亡早期,一些與膜通透性改變及凋亡有關(guān)的蛋白在細胞膜表面有特定表達。
通過FCM結(jié)合單克隆抗體可以檢測表達這些蛋白的細胞,從而確定細胞的凋亡情況。
多重耐藥性(multidrugresistance,MDR)是由多藥耐藥基因編碼的P糖蛋白(P-gp)親脂化合物,包括多種抗癌藥物和熒光染料的跨膜性排出泵。
從人淋巴細胞排除熒光染料與細胞內(nèi)P-gp的含量直接相關(guān)。
當(dāng)淋巴細胞出現(xiàn)MDR陽性細胞時,患者對化療藥物開始出現(xiàn)耐藥性,需要考慮其它治療方式。
多藥耐藥是腫瘤患者化療失敗的主要原因,FCM對多藥耐藥基因(如P170)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表達的測定,可為臨床治療效果分析提供有力依據(jù)[8]。
5 流式細胞術(shù)在器官移植中的應(yīng)用�
FCM在器官移植中占有重要地位,可被用來判斷供者與受者之間是否合適,用來鑒別和定型同種異體反應(yīng)抗體[6]。
通過供者白細胞和受者的血清共同孵育,如果受者血清中存在針對供者的循環(huán)抗體,就會同供者的淋巴細胞結(jié)合,再加入熒光素標(biāo)記的二抗來顯示這種結(jié)合,此方法能在移植手術(shù)前發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險的受體。
移植后免疫表型的監(jiān)測也很重要。
FCM可用于檢測移植后血液或移植內(nèi)免疫成分的變化,以預(yù)防移植后免疫�
排斥反應(yīng),細胞免疫抑制治療效果和移植存活情況,可敏感地預(yù)測排斥反應(yīng)的發(fā)生,為臨床治療提供有效依據(jù)。
6 流式細胞術(shù)在臨床細菌學(xué)中的應(yīng)用�
流式細胞術(shù)在臨床細菌學(xué)中的應(yīng)用具有快捷、靈敏,能同時進行多參數(shù)分析等優(yōu)點,可廣泛用于細菌、病原體、毒素和血清抗體及藥敏試驗。
免疫熒光檢測方法中的流式微球分析(CBA)是FCM的一個新應(yīng)用。
這種方法也可用于真菌、寄生蟲、病毒以及這些病原體的混合感染的檢測。
近年來,FCM與熒光染料的聯(lián)合運用可判斷細菌的活力和功能狀態(tài),由于速度快,該方法已被建議作為臨床實驗室的常規(guī)藥敏試驗。
FCM藥敏檢測方法較多,通過測量加入藥物孵育后的散射光的DNA含量來判斷抗生素對細菌的敏感性。
該法現(xiàn)被認為是FCM在該領(lǐng)域應(yīng)用的經(jīng)典方法[6]。
7 FCM在細胞生物學(xué)中的應(yīng)用�
在細胞周期內(nèi),DNA含量隨時相發(fā)生周期性的變化,通過熒光探針對細胞進行相對DNA含量測定,可分析細胞周期各時相細胞的百分比,周期動力學(xué)參數(shù)以及DNA異倍體。
可利用與鈣離子特異結(jié)合的熒光染料和激發(fā)光譜或發(fā)射光譜是pH值依賴熒光染料進行細胞內(nèi)鈣離子濃度測定和細胞內(nèi)pH值測定[9]。
8 流式細胞術(shù)在優(yōu)生遺傳領(lǐng)域中的應(yīng)用�
流式細胞術(shù)可使含量極微的胎兒有核紅細胞得到富集,因為有核紅細胞含有胎兒的全部基因,并具有不影響多胎妊娠等優(yōu)點,結(jié)合FISH,PCR等技術(shù),使之具有應(yīng)用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的廣闊前景[10]。
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流式細胞術(shù)在臨床檢驗中的應(yīng)用【2】
摘要 目的：通過了解和討論，對流式細胞術(shù)在臨床檢驗中的應(yīng)用情況做出詳細分析。
方法：通過多次嚴(yán)謹性實驗并且真實詳細記錄每次實驗數(shù)據(jù)，進一步分析流式細胞術(shù)在臨床檢驗中的應(yīng)用效果和可行性。
結(jié)果：經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)分析，流式細胞術(shù)在檢驗HLA-B27抗原、淋巴細胞亞群、腫瘤標(biāo)志物、白血病免疫、臨床微生物等應(yīng)用中有著明顯的效果。
結(jié)論：流式細胞術(shù)在臨床檢驗中可以得到很好的應(yīng)用。
關(guān)鍵詞 流式細胞術(shù);流式細胞儀;臨床檢驗;應(yīng)用
流式細胞術(shù)是一種生物學(xué)技術(shù)，用流式細胞儀(FACS)對懸浮于流體中的微小顆粒進行計數(shù)和分選。
這種技術(shù)可以用來對流過光學(xué)或電子檢測器的一個個細胞進行連續(xù)的多種參數(shù)分析。
流式細胞術(shù)(FCM)是對懸液中的單細胞或其他生物粒子，通過檢測標(biāo)記的熒光信號，實現(xiàn)高速、逐一的細胞定量分析和分選的技術(shù)。
FCM不但快速、靈敏而且還可以同時對多個參數(shù)進行分析，F(xiàn)CM在臨床微生物檢測中的作用受到越來越多人的關(guān)注。
FCM不但可以用來檢測受染細胞內(nèi)的病毒抗原，而且還可以對受染細胞表面的病毒抗原進行檢測。
由于FCM檢測的一般只是單個細胞，因此經(jīng)過FCM檢測的受染細胞只適用于支氣管灌洗液、血液、尿標(biāo)本以及一些經(jīng)酶消化過的組織細胞，同時由于FCM進行的是多參數(shù)分析。
所以FCM體外抗生素藥敏試驗的主要機制是，通過FCM檢測病原體和染料結(jié)合在一起后所發(fā)出的不同強度的熒光。
從而間接地反映出病原體的功能狀態(tài)以及活性，以達到幫助判斷病原體對抗生素的反應(yīng)性目的，其中用于研究抗菌效應(yīng)的熒光染料主要有2大類：其中用來標(biāo)記DNA和RNA的染料主要包括如溴化乙錠、碘化丙啶等;其次是用來反映代謝活性或結(jié)合蛋白的探針，其中包括異硫氰酸熒光素、膜電位敏感性染料等。
怎樣選擇這些物質(zhì)，與這種染料本身的發(fā)射特性有關(guān)，同時抗生素的作用機制也可能關(guān)系到這些物質(zhì)的選擇。
近年來FCM在細菌的藥敏效應(yīng)的研究領(lǐng)域已獲成功，將這些熒光染料和FCM聯(lián)合運用到一起，可以判斷其細菌活力與功能狀態(tài)，這種方法由于有速度快等優(yōu)勢，臨床實驗室的常規(guī)藥敏試驗中也應(yīng)用到這種方法。
方法
本實驗用到的細胞定量分析和分選技術(shù)，這個技術(shù)要用的實驗細胞包括MCF7、293(T)、U20S等。
以U20S細胞為例，他們通常所用的操作方法：首先對細胞進行培養(yǎng)以及鋪板，轉(zhuǎn)染、細胞分板、上機樣本制備、加藥刺激、細胞收獲及處理、相關(guān)試劑配制等步驟。
其中在細胞培養(yǎng)時，以U20S細胞作為細胞株和材料，在這個過程我們要注意的是一瓶細胞總數(shù)一般情況下會達到1×107個。
在鋪板的過程首先要對細胞進行分化，然后才對細胞進行計數(shù)，計數(shù)時如果發(fā)現(xiàn)細胞密度很大，影響計數(shù)，就必須對細胞進行合適倍數(shù)的稀釋后才計數(shù)。
最后才能進行鋪板。
鋪板的過程是：首先在6cm培養(yǎng)皿按照每孔6×105個的數(shù)量加入細胞，然后將6cm培養(yǎng)皿沿水平面方向前后左右來回晃動，使細胞能夠均勻分布，晃動時要小心以防止培養(yǎng)液潑出，再將細胞放置培養(yǎng)箱里生長。
將這些過程都完成后，然后可以用轉(zhuǎn)染色劑Lipofectamin2000進行轉(zhuǎn)染操作，其操作過程：首先在DEF-FN載體上構(gòu)建目的基因質(zhì)粒，當(dāng)細胞密度為達到50%～60%時，再進行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染12～16h后，再根據(jù)細胞密度按1：3進行分板，使分板后細胞密度30%左右。
除了以轉(zhuǎn)染質(zhì)粒作為陽性對照外，我們還可以以藥物處理細胞作為陽性對照。
將細胞鋪板24h后，再加藥對其進行刺激，加藥培養(yǎng)24h后，然后就可以對細胞進行收獲處理了。
注意在這個過程中要分別對培養(yǎng)液進行收集，在每個6cm規(guī)格的板中加入1mL胰酶進行消化。
待消化完畢后，再向內(nèi)一一對應(yīng)地加入已收集的培養(yǎng)液來中和胰酶。
上述過程進行完之后，最少要放置4h，才能從將細胞樣本從冰箱里取出進行離心操作來收集細胞。
將1×PBS清洗2遍后，再加入100μL 1×PBS將兩者混勻，加入10μL PI(終濃度100μg/mL)，10μLRnase(終濃度50μg/mL)，置于37℃水浴鍋，避光處理30min。
這樣才算完成上機樣本制備。
在處理分選細胞樣本前，要對細胞進行貼壁培養(yǎng)，每個細胞樣本至少需要1個10cm規(guī)格的細胞板，去除培養(yǎng)液酶消化，在37℃條件下充分消化至細胞輕拍脫壁，再加入5mL培養(yǎng)液進行中和，以充分分散細胞，取100μL細胞上機，測定轉(zhuǎn)染效率，剩余細胞計數(shù)、離心，根據(jù)轉(zhuǎn)染效率，分選模式，調(diào)節(jié)細胞濃度，達到上樣速率1000～3000個/s。
結(jié)果
經(jīng)過實驗分析得出結(jié)果，將其用于病毒檢測具有以下優(yōu)點及可行性：可在單個細胞中同時獲得多個分析參數(shù);能定量檢出受染細胞，當(dāng)用不同熒光染料標(biāo)記不同的病毒抗原特異性抗體或?qū)⑻禺愋圆《究贵w與不同大小的乳膠顆粒相聯(lián)時，F(xiàn)CM可同時檢測到同一樣本中的多種病毒或病毒抗原，這種方法也可用于真菌、寄生蟲、病毒以及這些病原體混合感染的檢測。
討論
隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，流式細胞技術(shù)也取得了快速的發(fā)展，其臨床應(yīng)用越來越廣泛，在臨床工作中發(fā)揮著重要的作用。
流式細胞術(shù)已普遍應(yīng)用于免疫學(xué)、細胞生物學(xué)、生物化學(xué)等臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。
隨著對FCM研究的日益深入，其價值已經(jīng)從科學(xué)研究走人了臨床應(yīng)用階段，在我國臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里已有著廣泛的應(yīng)用。
可見流式細胞術(shù)在臨床檢驗的應(yīng)用具有很好的發(fā)展前景和可靠性。
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