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蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析
論文摘要：隨著科學(xué)的不斷發(fā)展，運(yùn)用質(zhì)譜法進(jìn)行蛋白質(zhì)的分析日益增多，本文簡(jiǎn)要綜述了肽和蛋白質(zhì)等生物大分子質(zhì)譜分析的特點(diǎn)、方法及蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的原理、方式和應(yīng)用，并對(duì)其發(fā)展前景作出展望。
論文關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì) 質(zhì)譜分析 應(yīng)用
0 引言
蛋白質(zhì)是生物體中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物細(xì)胞，約占細(xì)胞干質(zhì)量的50%以上，作為生命的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，蛋白質(zhì)在催化生命體內(nèi)各種反應(yīng)進(jìn)行、調(diào)節(jié)代謝、抵御外來(lái)物質(zhì)入侵及控制遺傳信息等方面都起著至關(guān)重要的作用，因此蛋白質(zhì)也是生命科學(xué)中極為重要的研究對(duì)象。
1 質(zhì)譜分析的特點(diǎn)
質(zhì)譜分析用于蛋白質(zhì)等生物活性分子的研究具有如下優(yōu)點(diǎn)：很高的靈敏度能為亞微克級(jí)試樣提供信息，能最有效地與色譜聯(lián)用，適用于復(fù)雜體系中痕量物質(zhì)的鑒定或結(jié)構(gòu)測(cè)定，同時(shí)具有準(zhǔn)確性、易操作性、快速性及很好的普適性。
2 質(zhì)譜分析的方法
近年來(lái)涌現(xiàn)出較成功地用于生物大分子質(zhì)譜分析的軟電離技術(shù)主要有下列幾種：①電噴霧電離質(zhì)譜;②基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜;③快原子轟擊質(zhì)譜;④離子噴霧電離質(zhì)譜;⑤大氣壓電離質(zhì)譜。在這些軟電離技術(shù)中，以前面三種近年來(lái)研究得最多，應(yīng)用得也最廣泛。
3 蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析
蛋自質(zhì)是一條或多條肽鏈以特殊方式組合的生物大分子，復(fù)雜結(jié)構(gòu)主要包括以肽鏈為基礎(chǔ)的肽鏈線(xiàn)型序列[稱(chēng)為一級(jí)結(jié)構(gòu)]及由肽鏈卷曲折疊而形成三維[稱(chēng)為二級(jí)，三級(jí)或四級(jí)]結(jié)構(gòu)。目前質(zhì)譜主要測(cè)定蛋自質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數(shù)目和位置。
3.1 蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析原理 以往質(zhì)譜(MS)僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析，由于新的離子化技術(shù)的出現(xiàn)，如介質(zhì)輔助的激光解析/離子化、電噴霧離子化，各種新的質(zhì)譜技術(shù)開(kāi)始用于生物大分子的分析。其原理是：通過(guò)電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場(chǎng)、磁場(chǎng)將具有特定質(zhì)量與電荷比值(M/Z值)的蛋白質(zhì)離子分離開(kāi)來(lái)，經(jīng)過(guò)離子檢測(cè)器收集分離的離子，確定離子的M/Z值，分析鑒定未知蛋白質(zhì)。
3.2 蛋白質(zhì)和肽的序列分析 現(xiàn)代研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的小肽同蛋白質(zhì)一樣具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽庫(kù)是現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)之一。因此需要高效率、高靈敏度的肽和蛋白質(zhì)序列測(cè)定方法支持這些研究的進(jìn)行�，F(xiàn)有的肽和蛋白質(zhì)測(cè)序方法包括N末端序列測(cè)定的化學(xué)方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化學(xué)降解法等，這些方法都存在一些缺陷。例如作為肽和蛋白質(zhì)序列測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)方法的N末端氨基酸苯異硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又稱(chēng)PTH法)，測(cè)序速度較慢(50個(gè)氨基酸殘基/天);樣品用量較大(nmol級(jí)或幾十pmol級(jí));對(duì)樣品純度要求很高;對(duì)于修飾氨基酸殘基往往會(huì)錯(cuò)誤識(shí)別，而對(duì)N末端保護(hù)的肽鏈則無(wú)法測(cè)序。C末端化學(xué)降解測(cè)序法則由于無(wú)法找到PITC這樣理想的化學(xué)探針，其發(fā)展仍面臨著很大的困難。在這種背景下，質(zhì)譜由于很高的靈敏度、準(zhǔn)確性、易操作性、快速性及很好的普適性而倍受科學(xué)家的廣泛注意。在質(zhì)譜測(cè)序中，靈敏度及準(zhǔn)確性隨分子量增大有明顯降低，所以肽的序列分析比蛋白容易許多，許多研究也都是以肽作為分析對(duì)象進(jìn)行的。近年來(lái)隨著電噴霧電離質(zhì)譜(electrospray ionisation，ESI)及基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI)等質(zhì)譜軟電離技術(shù)的發(fā)展與完善，極性肽分子的分析成為可能，檢測(cè)限下降到fmol級(jí)別，可測(cè)定分子量范圍則高達(dá)100000Da，目前基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI TOF MS)已成為測(cè)定生物大分子尤其是蛋白質(zhì)、多肽分子量和一級(jí)結(jié)構(gòu)的有效工具，也是當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域中重大課題——蛋白質(zhì)組研究所必不可缺的關(guān)鍵技術(shù)之一。目前在歐洲分子生物實(shí)驗(yàn)室(EMBL)及美國(guó)、瑞士等國(guó)的一些高校已建立了MALDI TOF MS蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)(序列)譜庫(kù)，能為解析FAST譜圖提供極大的幫助，并為確證分析結(jié)果提供可靠的依據(jù)。
3.3 蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析方式 質(zhì)譜用于肽和蛋白質(zhì)的序列測(cè)定主要可以分為三種方法：一種方法叫蛋白圖譜(proteinmapping)，即用特異性的酶解或化學(xué)水解的方法將蛋白切成小的片段，然后用質(zhì)譜檢測(cè)各產(chǎn)物肽分子量，將所得到的肽譜數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索與之相對(duì)應(yīng)的已知蛋白，從而獲取待測(cè)蛋白序列。將蛋白質(zhì)繪制“肽圖”是一重要測(cè)列方法。第二種方法是利用待測(cè)分子在電離及飛行過(guò)程中產(chǎn)生的亞穩(wěn)離子，通過(guò)分析相鄰?fù)M類(lèi)型峰的質(zhì)量差，識(shí)別相應(yīng)的氨基酸殘基，其中亞穩(wěn)離子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用誘導(dǎo)碎裂.第三種方法與Edman法有相似之處，即用化學(xué)探針或酶解使蛋白或肽從N端或C端逐一降解下氨基酸殘基，形成相互間差一個(gè)氨基酸殘基的系列肽，名為梯狀測(cè)序(laddersequencing)，經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)，由相鄰峰的質(zhì)量差知道相應(yīng)氨基酸殘基。
3.3.1 蛋白消化 蛋白的基團(tuán)越大，質(zhì)譜檢測(cè)的準(zhǔn)確率越低。因此，在質(zhì)譜檢測(cè)之前，須將蛋白消化成小分子的多肽，以提高質(zhì)譜檢測(cè)的準(zhǔn)確率。一般而言，6-20個(gè)氨基酸的多肽最適合質(zhì)譜儀的檢測(cè)�，F(xiàn)今最常用的酶為胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的賴(lài)氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)處將其切斷。因此，同一蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化后，會(huì)產(chǎn)生相同的多肽。
3.3.2 基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)量法(MALDI-TOF MS) 簡(jiǎn)而言之，基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)量?jī)x是將多肽成分轉(zhuǎn)換成離子信號(hào)，并依據(jù)質(zhì)量/電荷之比(mass/charge，m/z)來(lái)對(duì)該多肽進(jìn)行分析，以判斷該多肽源自哪一個(gè)蛋白。
3.3.3 電子噴霧電離質(zhì)譜測(cè)量法(electrosprayion-izationmassspectrometry，ESI-MS)。
4 蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的應(yīng)用
1981年首先采用FAB雙聚焦質(zhì)譜測(cè)定肽分子量，分析十一肽(Mr=1318)，質(zhì)譜中出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子[M+1]+=1319強(qiáng)峰。在蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析中，質(zhì)譜的準(zhǔn)確性(accuracy)對(duì)測(cè)定結(jié)果有很大影響，因此質(zhì)譜測(cè)序現(xiàn)在仍很難被應(yīng)用于未知蛋白的序列測(cè)定。肽和蛋白的質(zhì)譜序列測(cè)定方法具有快速、用量少、易操作等優(yōu)點(diǎn)，這些都非常適合于現(xiàn)在科學(xué)研究的需要。我們相信，隨著各種衍生化方法和酶解方法的不斷改進(jìn)，蛋白雙向電泳的應(yīng)用以及質(zhì)譜技術(shù)的不斷完善，質(zhì)譜將會(huì)成為多肽和蛋白質(zhì)分析最有威力的工具之一。
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