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金納多合阿米洛利對(duì)大鼠肝纖維化模型的干預(yù)作用論文
【摘要】 目的 觀察銀杏葉提取物金納多合阿米洛利對(duì)大鼠肝纖維化模型的干預(yù)作用。方法 以二甲基亞硝胺造成大鼠肝纖維化模型，分別觀察金納多與阿米洛利干預(yù)后，羥脯氨酸、透明質(zhì)酸及層粘連蛋白含量的變化。結(jié)果 各給藥組（除阿米洛利組外）大鼠肝功能均較模型組有明顯改善；阿米洛利和金納多給藥組較模型組的血清透明質(zhì)酸、層粘連蛋白和肝組織羥脯氨酸含量降低(P<0.05)；肝組織內(nèi)SOD較模型組升高，而MDA低于模型組(P<0.01)；金阿合用組效果最佳。結(jié)論 金納多(銀杏葉提取物)與阿米洛利對(duì)二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型均有預(yù)防作用，兩者合用有一定的協(xié)同作用。目前認(rèn)為，肝纖維化可以預(yù)防和逆轉(zhuǎn)。近年來(lái)，已有不少學(xué)者以干擾肝纖維化形成過(guò)程中某一因素來(lái)干擾肝纖維化的發(fā)展，取得了一定成績(jī)。由于肝臟纖維化的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，有諸多因素參與，因此僅干擾其中某一因素效果并不理想。新近關(guān)于肝纖維化形成機(jī)制的研究表明氧應(yīng)激和交換泵在肝纖維化形成中起重要作用[1,2]，為抗肝纖維化的研究提供了新靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的肝纖維化模型，觀察聯(lián)用Na+/H+交換泵抑制劑阿米洛利（Amiloride）與抗氧化劑銀杏葉提取物金納多[3]（Ginaton）聯(lián)用對(duì)大鼠纖維化形成的影響，以探索臨床抗肝纖維化的新途徑�，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 動(dòng)物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量（180±30）g，購(gòu)于湖南中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（湘2002-003）。
1.1.2 藥物 阿米洛利，1 g/瓶，購(gòu)自Sigma公司；金納多(銀杏葉提取物)，5 g/瓶，由德國(guó)威瑪舒培大藥廠生產(chǎn)；二甲基亞硝胺，100 mL/瓶，購(gòu)于TCI公司。
1.1.3 儀器 752-紫外分光光度計(jì)上海第三分析儀器廠，LD5-2A離心機(jī)北京儀器廠，AA-160型電子天平德國(guó)Denver公司，SN-862型放射免疫γ計(jì)數(shù)器上海分析儀器廠。
1.1.4 試劑 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒為南京建成生物制品公司產(chǎn)品；透明質(zhì)酸（HA）和層粘連蛋白(LN)放免試劑盒購(gòu)自上海海軍生物醫(yī)學(xué)研究所。
1.2 方法
1.2.1 動(dòng)物分組與造模 模型建立參照文獻(xiàn)[4]。雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量150～210 g，隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、阿米洛利組、金納多組、金納多+阿米洛利組（簡(jiǎn)稱金阿合用組）、馬絡(luò)替酯組，每組10只。其中模型組及給藥組每周連續(xù)3 d腹腔注射二甲基亞硝胺10 mg/kg,共3周；各給藥組造模同時(shí)每日分別經(jīng)胃灌注阿米洛利(1 mg/kg)、金納多(40 mg/kg)、金阿合用組（與單用組濃度相同），共用藥3周；馬絡(luò)替酯組造模同時(shí)每日經(jīng)灌胃馬洛替酯[5]（90 mg/kg）；正常對(duì)照組每周連續(xù)3 d腹腔注射生理鹽水，共3周，同時(shí)每日灌胃生理鹽水共3周。第4周初，摘眼球采血后處死動(dòng)物，剪下完整肝臟組織標(biāo)本，稱肝質(zhì)量后取部分中葉肝臟以10%中性甲醛固定，3 d內(nèi)石蠟包埋，備病理檢測(cè)；將余下肝臟于液氮中速凍，備肝組織勻漿測(cè)組織MDA、SOV、羥脯氨酸、透明質(zhì)酸及層粘連蛋白，血清于-70 °C冰箱內(nèi)保存?zhèn)涓喂δ軝z測(cè)。
1.2.2 肝功能、脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)檢測(cè) MDA、GSH-PX、 SOD HA及LN均按試劑盒說(shuō)明測(cè)定。肝組織羥脯氨酸測(cè)定參照李文才等[6]的方法。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ｘ±ｓ)表示， 用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS10.0進(jìn)行單因素變量的方差分析和最小差值顯著法（LSD）的兩兩比較。
2 結(jié)果
2.1 一般情況
正常對(duì)照組大鼠一般狀態(tài)良好；模型組活動(dòng)少，皮毛欠光滑，尿色黃，有腹瀉。各給藥組大鼠精神活躍，毛發(fā)光滑，體型豐滿，無(wú)腹瀉。
2.2 肝功能指標(biāo)檢測(cè)
如表1所示：與正常組比較，模型組谷丙轉(zhuǎn)胺酶（ALT）和堿性磷酸酶（AlP）的水平明顯升高，白蛋白、球蛋白比（A/G）的水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；除了阿米洛利組外，其它給藥組ALT和AlP顯著低于模型組，而A/G顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；對(duì)ALT和A/G的影響金阿合用組優(yōu)于阿米洛利單用組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；對(duì)AlP的影響合用組優(yōu)于兩單用組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表1。
2.3 脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)
由表2可見：與正常組比較，模型組MDA的水平明顯升高，而SOD的活力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，給藥組不同程度明顯扭轉(zhuǎn)MDA和SOD，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；對(duì)MDA的影響金阿合用組優(yōu)于各單用組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），對(duì)SOD的影響金阿合用組優(yōu)于金納多單用組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但不優(yōu)于阿米洛利單用組。見表2。
2.4 對(duì)大鼠肝纖維化程度的影響
由表3可見：與正常組比較，模型組HA、LN和 HYP的含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；各給藥組不同程度明顯降低HA、LN和HYP的含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)HA和LN的影響，金阿合用組優(yōu)于各單用組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)HYP的影響，金阿合用組并不優(yōu)于單用組。見表3。
3 討論
本實(shí)驗(yàn)的研究表明， 阿米洛利與金納多對(duì)二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的肝纖維化具有明顯的預(yù)防作用。肝功能檢測(cè)提示金納多可減輕肝細(xì)胞的變性和壞死，并改善肝細(xì)胞功能，1 mg/kg的阿米洛利無(wú)此功效，表現(xiàn)為除了阿米洛利組，其余各組谷丙轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶較模型組顯著降低(P<0.001)，白蛋白、球蛋白比顯著升高(P<0.001)。膠原纖維主要由膠原蛋白所構(gòu)成，Hyp為膠原蛋白所特有的氨基酸成分，其在肝臟中的含量可反映膠原代謝的變化情況，與肝纖維化程度相平行。本研究通過(guò)檢測(cè)肝組織勻漿Hyp的含量發(fā)現(xiàn)，金納多與阿米洛利均可降低Hyp的含量，說(shuō)明阿米洛利與金納多均可抑制膠原的生成和沉積。氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過(guò)氧化是引起肝細(xì)胞損傷與肝星狀細(xì)胞活化的重要機(jī)制[7]。通過(guò)檢測(cè)肝組織勻漿中SOD、MDA含量發(fā)現(xiàn)，各給藥組的SOD較模型組顯著升高，而MDA顯著降低，說(shuō)明金納多有直接降低自由基生成，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化的作用。而阿米洛利可能是通過(guò)抑制肝星狀細(xì)胞激活、增殖及轉(zhuǎn)型，從而減輕脂質(zhì)過(guò)氧化的作用。對(duì)SOD、MDA的影響，合用組優(yōu)于單用組，說(shuō)明兩者在抗脂質(zhì)過(guò)氧化方面可能有協(xié)同效應(yīng)。肝星狀細(xì)胞活化為類肌成細(xì)胞，大量合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。本研究通過(guò)檢測(cè)HA和LN的水平發(fā)現(xiàn)，金納多與阿米洛利均可降低HA和LN的水平，尤以合用組最低，說(shuō)明金納多與阿米洛利可以抑制肝星狀細(xì)胞活化，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌。總之，金納多保護(hù)肝細(xì)胞及抑制肝星狀細(xì)活化的作用與阿米洛利抑制肝星狀細(xì)胞活化的作用可能正是它們合用效果更佳的原因。
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