葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)作用

　　每年的大學(xué)畢業(yè)生，免不了都要寫(xiě)論文，下面文書(shū)幫小編給大家?guī)��?lái)一篇論文范文，歡迎閱讀！

       【摘要】 觀察葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)作用�！痉椒ā繉�NIH小鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組，模型組，葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)高、中、低劑量組(劑量分別為110、55、27.5g·kg-1)，聯(lián)苯雙酯組(150mg·kg-1);以刀豆蛋白A(Con A)和D?氨基半乳糖(D?GalN)分別復(fù)制小鼠急性肝損傷模型，用葉下珠復(fù)方II號(hào)水提液進(jìn)行干預(yù)治療，并與聯(lián)苯雙酯進(jìn)行對(duì)照，檢測(cè)小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶( ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及肝組織超氧化物歧化酶(SOD)活性，并觀察肝組織病理改變。【結(jié)果】葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)可顯著性降低兩種實(shí)驗(yàn)性肝損傷小鼠血清ALT和AST活性，升高肝損傷小鼠肝組織SOD活性，與模型組比較差異有顯著性意義(P<0.01)，與聯(lián)苯雙酯組比較差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)，且可明顯減輕肝組織病理改變。 【結(jié)論】 葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)對(duì)刀豆蛋白A和D?氨基半乳糖所致小鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷具有較好的保護(hù)作用，作用機(jī)制與抑制脂質(zhì)過(guò)氧化損傷有關(guān)。

　　【關(guān)鍵詞】 葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)/藥理學(xué) 肝損傷/中藥療法 肝/病理學(xué) 疾病模型 動(dòng)物 小鼠

　　葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)是在葉下珠復(fù)方[1]的基礎(chǔ)上加入桃仁、苦參等藥物組方而成，具有解毒活血、疏肝健脾作用，臨床上主要用于慢性乙型肝炎和肝纖維化的治療。為探討該復(fù)方對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷保護(hù)作用的效果，我們以NIH小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察該方對(duì)刀豆蛋白A(Con A)所致免疫性肝損傷模型和D?氨基半乳糖(D?GalN)所致化學(xué)性肝損傷模型的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

　　1 材料與方法

　　1.1 動(dòng)物 NIH小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK(粵)2003-0001。

　　1.2 藥物 葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)組方藥材購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，水煎2次，混合后濃縮成含生藥4kg/L，用時(shí)以蒸餾水配成所需濃度;聯(lián)苯雙酯滴丸由北京協(xié)和制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)04060106，每丸含聯(lián)苯雙酯7.5mg，試驗(yàn)時(shí)以30g/L的二甲基亞砜溶解，再用蒸餾水稀釋至所需濃度;刀豆蛋白A(Con A)為美國(guó)華盛頓生物藥品公司產(chǎn)品;D?氨基半乳糖(D?GalN)由重慶醫(yī)科大學(xué)生化教研室生產(chǎn)，批號(hào)050326。

　　1.3 主要試劑與儀器 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測(cè)試劑盒均由上海榮盛生物技術(shù)有限公司提供，批號(hào)為20050125;超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào)20041108;722型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠);TLL?C臺(tái)式冷凍離心機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠); CK40?F200型顯微鏡(Olympus Optical Co.Ltd)。

　　1.4 ConA致小鼠急性肝損傷模型復(fù)制及分組、給藥方法[2] 將60只NIH小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為正常對(duì)照組，模型組，葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)高、中、低劑量組(簡(jiǎn)稱中藥高、中、低劑量組，劑量分別為110、55、27.5g·kg-1，相當(dāng)于20倍、10倍和5倍臨床用藥劑量)，聯(lián)苯雙酯(150mg·kg-1)治療組。除正常對(duì)照組外，其他各組小鼠于實(shí)驗(yàn)首日上午尾靜脈注射ConA20mg·kg-1，各給藥組于首日、次日和第3日上午予小鼠灌胃給藥1次;末次給藥后4h，模型組和各給藥組小鼠再次尾靜脈注射ConA20mg·kg-1，禁食不禁水，8h后摘眼球取血，分離血清待檢;斷頭處死動(dòng)物，取肝左葉組織，一部分用體積分?jǐn)?shù)為40%甲醛溶液固定，另一部分制成勻漿待檢。

　　1.5 D?GalN致小鼠急性肝損傷模型的復(fù)制及分組、給藥方法[3] 分組和劑量設(shè)計(jì)同1.4，各治療組小鼠每日灌胃給藥1次，連續(xù)4d。末次給藥后1h，除正常對(duì)照組外，其他組小鼠均以D?GalN 800mg·kg-1腹腔注射，禁食不禁水，24h后摘眼球取血，分離血清待檢;斷頭處死動(dòng)物，取肝左葉組織，一部分用體積分?jǐn)?shù)為40%甲醛溶液固定，另一部分制成勻漿待檢。

　　1.6 血漿ALT、AST活性檢測(cè) 采用賴氏法，按試劑盒說(shuō)明操作，采用722型紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)505nm處檢測(cè)吸光值,制定標(biāo)準(zhǔn)曲線,換算成ALT、AST值。

　　1.7 肝組織SOD活性測(cè)定 將肝組織制成100g/L勻漿，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，按試劑盒說(shuō)明操作。

　　1.8 組織病理學(xué)觀察 以體積分?jǐn)?shù)為40%甲醛溶液固定肝組織, 石蠟包埋切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察、拍照。

　　1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,多組計(jì)量資料分析采用One?way ANOVA法,多重比較采用LSD法。

　　2 結(jié)果

　　2.1 葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)對(duì)Con A致小鼠急性肝損傷模型的保護(hù)作用 由表1可知，模型組小鼠血清ALT、AST活性較正常對(duì)照組升高，肝組織SOD活性較正常對(duì)照組降低，差異均有顯著性意義(P<0.01)。中藥高、中、低劑量組ALT、AST活性均低于模型組，差異有顯著性意義(P<0.01)，而與聯(lián)苯雙酯組比較，差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。中藥高、中、低劑量組肝組織中SOD的活性高于模型組，差異有顯著性意義(P <0.01)， 但與聯(lián)苯雙酯組比較，差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。

　　肝組織病理學(xué)觀察：光鏡下見(jiàn)正常對(duì)照組肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝竇未見(jiàn)異常。模型組全部小鼠肝組織均出現(xiàn)明顯病變，小葉內(nèi)大多數(shù)肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞質(zhì)疏松化，有的呈氣球樣變，可見(jiàn)凋亡小體、明顯的點(diǎn)狀壞死和灶性壞死，壞死灶可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);匯管區(qū)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞炎性浸潤(rùn)尤為明顯,肝竇內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞淤積。葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)高、中劑量組和聯(lián)苯雙酯組部分肝組織可見(jiàn)散在點(diǎn)狀壞死和灶性壞死，肝細(xì)胞損傷程度明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少(圖1)。

　　2.2 葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)對(duì)D?GalN致小鼠急性肝損傷模型的保護(hù)作用 由表2可知，模型組小鼠血清ALT、AST活性較正常對(duì)照組升高，肝組織SOD活性較正常組降低，差異均有顯著性意義(P<0.01)。除中藥低劑量組血清ALT外，中藥各組血清ALT、AST活性降低，肝組織SOD活性升高，與模型組比較有顯著性差異(均P <0.01)，與聯(lián)苯雙酯組比較差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。

　　肝臟組織病理學(xué)觀察：光鏡下見(jiàn)正常對(duì)照組肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無(wú)病理性改變。模型組全部小鼠肝組織均出現(xiàn)病變，大多數(shù)肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞質(zhì)疏松化，有的呈氣球樣變，可見(jiàn)廣泛的肝細(xì)胞脂肪變性、點(diǎn)狀壞死和灶性壞死，并出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)高、中劑量組和聯(lián)苯雙酯組肝細(xì)胞變性、壞死程度顯著減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少,肝組織病變明顯改善(圖2)。表1 葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)對(duì)Con A致肝損傷小鼠血清ALT、AST及肝組織SOD活性的影響表2 葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)對(duì)D?GalN所致肝損傷小鼠血清ALT、AST及肝組織SOD活性的影響

　　3 討論

　　Con A是一種被廣泛應(yīng)用的可活化T細(xì)胞的有絲分裂原，ConA誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷模型，被認(rèn)為更適合研究人類(lèi)病毒性肝炎和自身免疫性肝病的病理機(jī)制和進(jìn)行抗肝損傷的藥物篩選[4 -5]。ConA活化TH細(xì)胞后刺激TH細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共同產(chǎn)生過(guò)量的干擾素γ(IFN?γ)和腫瘤壞死因子(TNF?α)等細(xì)胞因子，已證實(shí)TNF?α為細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中介導(dǎo)肝損傷的終末介質(zhì)，它既是肝細(xì)胞凋亡的正性觸發(fā)因子,可直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，亦可活化中性粒細(xì)胞促進(jìn)其趨化聚集于肝臟，釋放蛋白酶或氧自由基引起肝細(xì)胞凋亡或壞死[6-7]。

　　D?GalN所致中毒性肝損傷模型的肝組織病理學(xué)和生化改變與人類(lèi)病毒性肝炎相似，是評(píng)價(jià)保肝藥物效果和研究其作用機(jī)理的經(jīng)典動(dòng)物模型之一。以往認(rèn)為D?氨基半乳糖氨引起的肝細(xì)胞損傷的機(jī)制是D?GalN在肝細(xì)胞內(nèi)與尿苷二磷酸(UDP)結(jié)合，形成UDP?半乳糖氨復(fù)合物，使尿苷三磷酸(UTP)耗竭、尿苷類(lèi)化合物環(huán)化不能進(jìn)行，致使RNA和蛋白質(zhì)合成受阻，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死[8]。近年的研究表明，D?GalN可引起肝細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多，鎂離子減少，鈣離子增多則抑制線粒體的呼吸功能，激活磷脂酶，分解膜磷脂，破壞溶酶體膜，使蛋白水解酶釋放，并使黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，加速氧自由基的產(chǎn)生，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，破壞肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，造成胞漿內(nèi)可溶性酶如轉(zhuǎn)氨酶等滲入血液而活性升高，使肝細(xì)胞損傷進(jìn)一步加劇[9-10] 。

　　SOD是氧自由基的清除劑，可抑制自由基啟動(dòng)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，肝細(xì)胞受到自由基攻擊時(shí)，SOD可因其過(guò)度消耗而減少，SOD活力的高低間接反映了機(jī)體清除自由基和抗組織過(guò)氧化損傷的能力[11] 。

　　本實(shí)驗(yàn)采用Con A致免疫性肝損傷和D?GalN致化學(xué)性肝損傷兩種動(dòng)物模型，觀察葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)的抗肝損傷作用效果，結(jié)果表明葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)可顯著性降低兩種實(shí)驗(yàn)性肝損傷小鼠血清ALT和AST活性，升高肝損傷小鼠肝組織SOD活性，與模型組比較差異有顯著性意義(P<0.01)，與聯(lián)苯雙酯組比較差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)，且可明顯減輕肝組織病理變化。提示葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)具有較好的降酶保肝作用，其作用可能與增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，加速自由基的清除，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化損傷有關(guān)，確切機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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