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不同谷物籽粒木聚糖酶抑制蛋白活性的分布特征
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論文導(dǎo)讀：谷物籽粒中木聚糖酶抑制蛋白對(duì)其種子保存和萌發(fā)都有重要作用，本實(shí)驗(yàn)選取小麥、大麥、黑麥、綠粒小麥、蕎麥、燕麥、玉米、水稻和高粱九種常見的谷物為材料，研究了籽粒木聚糖酶抑制蛋白活性。結(jié)果表明，木聚糖酶抑制蛋白活性則在小麥、黑麥、綠麥和蕎麥中較高，在大麥、燕麥中較低，玉米、水稻和高粱中沒有發(fā)現(xiàn)木聚糖酶抑制蛋白活性。進(jìn)一步選取木聚糖酶抑制蛋白活性較高的小麥、黑麥和綠粒小麥，分別測(cè)定其種皮、胚和胚乳中的木聚糖酶抑制蛋白活性。研究發(fā)現(xiàn)，三種麥類表現(xiàn)出一致的結(jié)果，即木聚糖酶抑制蛋白活性在胚和胚乳中基本持平，并且遠(yuǎn)高于種皮。
論文關(guān)鍵詞：谷物，籽粒，木聚糖酶抑制蛋白
內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8，以下簡稱木聚糖酶)能專一性水解組成植物細(xì)胞壁的主要成分木聚糖的β-1,4-木糖苷鍵[1]。微生物發(fā)酵生產(chǎn)的木聚糖酶已廣泛用于麥型飼料添加、面包加工等領(lǐng)域。
近年來，在小麥、玉米等不同谷物中發(fā)現(xiàn)了木聚糖酶的抑制蛋白的存在，這些抑制蛋白對(duì)谷物自身的木聚糖酶不起作用，而特異性地抑制外源木聚糖酶的活性。由于其可能的對(duì)外源添加在谷物中的木聚糖酶功效的影響，有關(guān)木聚糖酶抑制蛋白的研究日益深入。目前已從小麥中純化得到三種類型木聚糖酶抑制蛋白，即TAXI (Triticumaestivum xylanase inhibitor)[2]、XIP(xylanase inhibitor protein)[3]、TLXI(thaumatin-like xylanase inhibitor) [4]。不同類型的抑制蛋白分子量、等電點(diǎn)有所不同，對(duì)木聚糖酶的抑制特異性也有差異龍?jiān)雌诳ＴS多研究表明生物論文，谷物中木聚糖酶抑制蛋白的存在與植物抵御病原菌的入侵有關(guān)[5-6]。
在木聚糖酶應(yīng)用領(lǐng)域，如面包加工[7]、飼料加工[8]、小麥谷朊粉-淀粉分離[9-10]等過程，已有研究證實(shí)，谷物中木聚糖酶抑制蛋白的存在會(huì)導(dǎo)致木聚糖酶作用效率降低，影響谷物加工過程或谷物飼料的利用率。為準(zhǔn)確了解谷物中木聚糖酶抑制蛋白對(duì)谷物加工過程的阻礙作用，以采取措施最大程度地發(fā)揮木聚糖酶作用功效，本研究首先分析了不同谷物中木聚糖酶抑制蛋白的存在狀況及分布特征，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
1 材料與方法
1.1 谷物材料
黑麥、燕麥、綠麥、蕎麥、水稻、高粱均購自鄭州市種子市場(chǎng);小麥和大麥分別由國家小麥工程技術(shù)研究中心的牛吉山老師和牛洪斌老師惠贈(zèng);玉米由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物解剖與生理研究室提供，所用谷物籽粒發(fā)芽率均達(dá)到95%以上。
1.2 谷物籽粒中粗蛋白的提取
用粉碎機(jī)將各樣品粉碎，過篩0.4 mm、40目，稱取5g粉碎過篩的全籽粒粉，加入25 mL蒸餾水，在小三角瓶中混合均勻，在5℃的搖床上180 r/min振蕩30 min，4℃、6000 r/min離心15min，再取1mL上清放入1.5 mL小離心管中生物論文，4℃，12000 r/min離心10 min，得到的上清即為提取的粗蛋白液。
1.3 谷物不同部位粗蛋白的提取
將小麥、黑麥和綠粒小麥稍濕水將胚用針剝下來，然后在研砵里輕磨將種皮去掉，最后將各部分都晾干粉碎同樣過篩0.4 mm、40目。稱量分離并粉碎好的各部分1 g，加入5 mL蒸餾水充分混勻在5℃的搖床上180 r/min振蕩30 min，4℃,6000 r/min離心15 min，再取1 mL上清放入1.5 mL小離心管中，4℃、12000 r/min離心10 min，得到的上清即為粗蛋白提取液。
1.4木聚糖酶抑制活性的測(cè)定
以畢赤酵母工程菌發(fā)酵產(chǎn)生的GH11家族木聚糖酶(基因登錄號(hào)：EU375728)為測(cè)定木聚糖酶抑制活性時(shí)的指示酶，具體方法如下：
取木聚糖酶酶液，適當(dāng)稀釋酶液使其木聚糖酶活力測(cè)定OD值在0.6～0.8(相當(dāng)于0.92～1.23 IU/mL木聚糖酶)，用來測(cè)定木聚糖酶抑制蛋白的抑制活性。取兩份200 μL的木聚糖酶酶液，一份加入200 μL的抑制蛋白，另一份加入200 μL的0.2 mol/L pH7.0磷酸緩沖液，混勻生物論文，30℃保溫30 min。從保溫后的兩份混合液中分別取100 μL，測(cè)定其木聚糖酶活性[6]。以加入緩沖液的反應(yīng)管的木聚糖酶活力為對(duì)照，加入抑制蛋白的樣品每降低0.01個(gè)木聚糖酶活力單位定義為1個(gè)木聚糖酶抑制單位(IA)。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同谷物的木聚糖酶抑制蛋白活性
實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定了小麥、大麥、黑麥、綠粒小麥、蕎麥、燕麥、玉米、水稻和高粱九種谷物的木聚糖酶抑制蛋白活性，結(jié)果如圖1所示。由圖可知，小麥、黑麥、綠粒小麥、大麥、燕麥和蕎麥中均有木聚糖酶抑制蛋白活性，其中小麥、黑麥、綠粒小麥和蕎麥中明顯較高，而在玉米、水稻和高粱中未檢測(cè)到木聚糖酶抑制蛋白活性龍?jiān)雌诳?/p>
2.2 小麥、黑麥和綠粒小麥不同部位的木聚糖酶抑制蛋白活性
選取測(cè)得的木聚糖酶抑制蛋白活性高的三種麥類即小麥、黑麥和綠粒小麥，測(cè)定其不同部位的木聚糖酶抑制蛋白活性，結(jié)果如圖2。由圖可知，三種麥類籽粒不同部位木聚糖酶抑制蛋白活性表現(xiàn)出一致的測(cè)定結(jié)果，即胚和胚乳中都具有較高的木聚糖酶抑制蛋白活性，而種皮中木聚糖酶抑制蛋白活性較低甚至檢測(cè)不到。 3 討論
本研究證實(shí)國內(nèi)小麥(包括綠粒小麥品種)、大麥、黑麥中都含有不同水平的木聚糖酶抑制蛋白活性，與Goesaert等[11]結(jié)果一致;而在玉米、水稻、高梁中未檢出木聚糖酶抑制蛋白活性。與Goesaert等[12]結(jié)果顯著不同的是，本研究明確地顯示了燕麥和蕎麥中也具有木聚糖酶抑制蛋白活性，原因可能主要為所用谷物材料品種的不同導(dǎo)致結(jié)果有差異，正如小麥不同品種間木聚糖酶抑制活性存在明顯差異一樣[13];另外生物論文，由于某些類型的木聚糖酶抑制蛋白如taxi-III、taxi-IV 和XIP-I等是誘導(dǎo)性蛋白[14]，同一谷物在不同地區(qū)被病原真菌感染的程度不同，其表現(xiàn)出的木聚糖酶抑制蛋白含量也會(huì)不同;這些因素都會(huì)導(dǎo)致有關(guān)木聚糖酶抑制蛋白存在情況的差異。更為可靠的方法可以通過對(duì)三型抑制蛋白的免疫印跡定量來實(shí)現(xiàn)。
Croes等[15] 采用免疫印跡定量法測(cè)定了小麥不同組分木聚糖酶抑制蛋白含量，結(jié)果顯示木聚糖酶抑制蛋白都是在富含糊粉組分(aleurone-richfraction)中含量最高，是白面粉組分(whiteflour)的4倍，是富含皮層組分(pericarp-richfraction)的10倍。本實(shí)驗(yàn)只將最外層種皮分離開來而沒有將糊粉層分開，絕大部分糊粉層都存在于胚乳成分中，這導(dǎo)致胚乳中木聚糖酶抑制蛋白活性較高，由此可推測(cè)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Croes等的測(cè)定結(jié)果基本吻合。本研究對(duì)小麥不同部位木聚糖酶抑制活性的量化分析將對(duì)以小麥為原料的木聚糖酶應(yīng)用過程具有一定的酶效評(píng)估意義。
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