不同血管段活性差異對葛根素血管舒張作用機制的影響

　　摘要：研究離體血管環(huán)試驗中不同血管段活性差異對葛根素(Puerarin，Pue)的舒張作用差異并探討其機制。方法：SD大鼠36只，常規(guī)方法制備離體血管環(huán)標本，分為內(nèi)皮完整組和內(nèi)皮組兩大組，其中每組都設(shè)有遠心段、中段和近心段三組。用離體血管灌流大鼠胸主動脈環(huán)，血管基礎(chǔ)張力定為9.8×10-3 N(1 g)，測定各組血管環(huán)張力及葛根素pEC50。內(nèi)皮完整組分別加入L-NAME與葛根素(浴槽終濃度為10-4 mol•L-1)共同孵育，測定血管環(huán)張力變化，并計算pEC50。結(jié)果：葛根素在10-7～10-4 mol•L-1范圍內(nèi)對腹主動脈具有劑量依賴性的舒血管效應(yīng)，在10-4 mol•L-1達到(61.2±3.7)%的最大舒張;去內(nèi)皮后其舒血管效應(yīng)可降低(34.6±6.1)%，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);遠心段去內(nèi)皮及內(nèi)皮完整血管環(huán)Emax均較近心段和中段比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);內(nèi)皮完整遠心段組中，葛根素與L-硝基精氨酸(L-NAME)共同孵育后，Emax顯著下降(P<0.05);而近心段和中段組中，L-NAME與葛根素共同孵育組血管舒張的受抑制程度與葛根素組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組pEC50比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論：葛根素具有內(nèi)皮依賴性的舒血管效應(yīng)，但不同血管段中舒張活性存在差異，該作用與NO系統(tǒng)有關(guān)。

　　關(guān)鍵詞：葛根素;胸主動脈環(huán);NO合成酶;血管舒張

　　葛根素(Puerarin，Pue)具有擴血管、降血壓、抗心肌缺血等作用。以往研究表明葛根素擴血管機制存在爭議，可能與實驗條件和動物種屬不同有關(guān)。本文的研究旨針對血管條的不同血管段血管活性不同對于葛根素血管舒張作用機制的影響，應(yīng)用NO合酶抑制劑L-硝基精氨酸(L-NAME)，探討葛根素對不同胸主動脈段的舒張作用與NO的關(guān)系，觀察葛根素的舒血管作用機制。

　　1 資料與方法

　　1.1 實驗材料

　　1.1.1 實驗動物：SD大鼠36只，體重250～300 g，雌雄兼用，由青龍山動物中心提供。

　　1.1.2 藥品：重酒石酸去甲腎上腺素(Noradrenaline Bitartrate，NA)購自天津金耀氨基酸有限公司，批號：0803192;苯腎上腺素(Phe)，L-硝基精氨酸(L-NAME)購自Fluka，批號：1115878、40705093;氯化乙酰膽堿(Ach)購自Alfa Aesar公司，批號：10132497;葛根素，由南京師范大學袁生教授實驗室提供;溶于50%丙二醇進行實驗。

　　1.1.3 試劑：K-H液：NaCl 118.0 mM，KCl 4.7 mM，NaHCO3 25.0 mM，KH2PO4 1.2 mM，MgSO4 1.2 mM，CaCl2 2.5 mM，glucose 11.0 mM。均為普通國產(chǎn)分析純。

　　1.1.4 儀器：MD 2 000生物信號采集系統(tǒng)購自南京醫(yī)科大學。

　　1.2 實驗方法

　　1.2.1 不同種屬動物胸主動脈環(huán)制備：20%烏拉坦(給藥計量1 g/kg)麻醉，給藥量為0.6 ml/100 g。取正常大鼠胸主動脈，置于預(yù)冷以100% O2飽和的K-H液中，去除血管周圍結(jié)締組織，制備成3～4 mm的血管環(huán)，并懸掛于盛有預(yù)先以95% CO2混合氣體的K-H液的5 ml浴皿中，下段用鋼絲鉤固定住，上段與張力換能器相連，用MD 2 000生物信號采集系統(tǒng)記錄張力Emax。浴皿中持續(xù)通入氣體，保持(37±0.5)的恒溫，給予不同前負荷，15 min換1次緩沖液，平衡60 min，加入NA(浴槽終濃度10-6 mol·L-1)預(yù)收縮2次，用K-H液洗脫至基線后進行下列實驗。去內(nèi)皮組以機械法去除內(nèi)皮。血管內(nèi)皮活性的檢驗：用Phe(浴槽終濃度10-6 mol·L-1)處理動脈環(huán)使其收縮至平臺，加入Ach(浴槽終濃度10-5 mol·L-1)動脈環(huán)舒張至平臺，檢驗內(nèi)皮完整性，舒張活性>70%為內(nèi)皮完整;舒張活性<20%則認為內(nèi)皮去除。

　　1.2.2 葛根素對苯腎上腺素引起的收縮的影響：隨機選取大鼠胸主動脈環(huán)，分為去內(nèi)皮組、內(nèi)皮完整組、溶劑對照及正常對照組，葛根素用Phe(浴槽終濃度10-6 mol·L-1)處理動脈環(huán)使其收縮至平臺，加入葛根素(浴槽終濃度10-7～10-4 mol·L-1)動脈環(huán)舒張至平臺，記算舒張百分數(shù)。

　　1.2.3 胸主動脈環(huán)的區(qū)域差異性：將大鼠的胸主動脈從近心段開始剪成6段，編號1～6，取1、3、6分為作為近心段、中段和遠心段，進行實驗[1]。分為去內(nèi)皮組和內(nèi)皮完整組。兩組動脈環(huán)分別經(jīng)預(yù)處理后，使溶液中累加苯腎上腺素的濃度依次(10-9～10-5 mol·L-1)，測定Phe引起大鼠胸主動脈條收縮的改變。后用K-H液洗3次，待主動脈條張力恢復(fù)正常并平衡45 min后，加入，孵育20 min后重復(fù)以上過程;或用L-NAME(浴槽終濃度10μmol·L-1)和葛根素(引起最大舒張百分數(shù)的濃度)共同孵育20 min后，重復(fù)以上實驗。

　　2 結(jié)果

　　葛根素最大舒張濃度：結(jié)果如圖1所示，葛根素引起最大舒張的濃度為10-4 mol·L-1，去內(nèi)皮組和內(nèi)皮完整組的最大舒張百分數(shù)為(40.2±7.78)%和(61.2±3.87)%，與溶劑及正常對照組相比，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);葛根素對去內(nèi)皮組與內(nèi)皮完整組的舒張作用比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，去內(nèi)皮組明顯舒張作用下降;溶劑與正常對照組相比，比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明其對體外血管環(huán)無影響。

　　3 討論

　　體外血管環(huán)實驗作為篩選心血管活性化合物及研究心血管活性物質(zhì)的作用機制常用的基礎(chǔ)實驗被廣泛應(yīng)用，但同時由于不同種屬動物不同部位的血管作用仍存在差異，并且操作規(guī)范因人而異，從而相同化合物可能得到不同結(jié)果。而葛根素舒張血管作用機制在國內(nèi)外文獻中就大不相同。本文著重研究了體外血管環(huán)試驗中容易被忽略的因素，即遠心段、中段與近心段的血管環(huán)活性差異。

　　早在上世紀80年代，Kita T等[2]在研究中就發(fā)現(xiàn)在家兔家族性高膽固醇血癥模型中，遠段胸主動脈的血管損傷程度要比其他段血管嚴重許多。而在Honda H等[1]研究中，則發(fā)現(xiàn)中段和遠心段血管較近心段血管舒張作用的不同與乙酰膽堿誘導的內(nèi)皮源性NO的釋放有關(guān)。本實驗中遠心段血管環(huán)對于異丙腎上腺素誘導的血管收縮活性以及葛根素誘導的血管舒張作用活性較中段和近心段血管環(huán)弱。而葛根素于L-NAME孵育后乙酰膽堿誘導的血管舒張作用均減弱，但對于遠心段血管環(huán)作用最強，產(chǎn)生這種作用的機制可能與不同血管段合成NO能力不同有關(guān)。而中段和近心段血管在葛根素和L-NAME共同孵育后Emax雖升高，但比較差異無統(tǒng)計學意義，提示現(xiàn)有文獻報道中葛根素的舒血管作用機制的爭議可能與血管環(huán)樣本的選擇有關(guān)。但遠心段血管環(huán)與中段、近心段血管環(huán)活性差異的進一步機制仍值得深入研究。