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枸杞多糖對(duì)大鼠腰椎間盤(pán)退變影響的形態(tài)學(xué)
枸杞多糖對(duì)大鼠腰椎間盤(pán)退變影響的形態(tài)學(xué)
【摘要】 目的 探討枸杞多糖(LBP)對(duì)大鼠退變腰椎間盤(pán)的形態(tài)學(xué)的影響。
方法 將健康雄性SD大鼠42只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、椎間盤(pán)退變組、LBP干預(yù)組，每組14只。
采用手術(shù)方法制作大鼠腰椎間盤(pán)退變模型，LBP干預(yù)組在造模后4周，每天上午8：00灌胃給藥，80mg?mL-1，容量為1mL?kg-1，連續(xù)4周。
假手術(shù)組及椎間盤(pán)退變組分別給予等容量生理鹽水灌胃，連續(xù)4周。
在造模后8周三組所有大鼠再次麻醉，取出椎間盤(pán)組織，分別在光鏡及電鏡下觀察椎間盤(pán)形態(tài)學(xué)的變化。
結(jié)果 HE染色光鏡觀察假手術(shù)組髓核細(xì)胞豐富，形態(tài)不規(guī)則，集中成簇;椎間盤(pán)退變組髓核細(xì)胞稀少，細(xì)胞基質(zhì)見(jiàn)大量的空泡;LBP干預(yù)組髓核細(xì)胞有變性、壞死，但較椎間盤(pán)退變組退變程度減輕。
電鏡下假手術(shù)組的髓核細(xì)胞多見(jiàn)，核膜完整，細(xì)胞器豐富;椎間盤(pán)退變組髓核細(xì)胞減少，細(xì)胞器缺失，見(jiàn)大量的空泡;LBP干預(yù)組髓核細(xì)胞減少，有變性、壞死，退變較椎間盤(pán)退變組減輕。
結(jié)論 LBP可能對(duì)大鼠腰椎間盤(pán)髓核組織退變有延緩作用。
【關(guān)鍵詞】 腰椎間盤(pán);退變;枸杞多糖
腰椎間盤(pán)退行性變(Intervertebral Disc Degeneration，IVDD)是導(dǎo)致下腰痛和神經(jīng)痛的主要原因[1-2]。
椎間盤(pán)退變是個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，引起退變的確切原因尚不清楚。
目前研究的關(guān)注點(diǎn)在于如何尋找有效的藥物或生物制劑抑制細(xì)胞因子或炎癥介質(zhì)，從而延緩或抑制椎間盤(pán)退變的發(fā)生、發(fā)展。
實(shí)驗(yàn)證實(shí)[3-4]椎間盤(pán)退變表現(xiàn)為一系列組織形態(tài)學(xué)上的變化。
觀察用藥后椎間盤(pán)組織形態(tài)學(xué)的變化，可驗(yàn)證藥物或生物制劑對(duì)椎間盤(pán)組織的作用。
本實(shí)驗(yàn)采用枸杞多糖(Lycium Barbarum Polysaccharides，LBP)作為干預(yù)劑作用于腰椎間盤(pán)組織退變的大鼠，并通過(guò)組織形態(tài)學(xué)的觀察以驗(yàn)證其對(duì)椎間盤(pán)退變組織的影響。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
選取雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠42只，購(gòu)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重400～476g，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(寧)2005-0001。
1.2 藥品及試劑
LBP溶液(寧夏啟元藥業(yè)公司生產(chǎn)的粉劑，批號(hào)：GF03002-l，純度58.56%)，使用前用生理鹽水配制80mg?mL-1新鮮溶液。
1.3 方法
1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
隨機(jī)將大鼠分為假手術(shù)組(14只)、椎間盤(pán)退變組(14只)和LBP藥物干預(yù)組(14只)。
1.3.2 大鼠腰椎間盤(pán)退變?cè)炷?/p>
采用陳德勝等[5]建立大鼠腰椎間盤(pán)退變模型的方法，以6.5%的水合氯醛(購(gòu)于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院制劑中心)0.055mL?kg-1腹腔注射麻醉SD大鼠無(wú)菌條件下沿腰背部棘突做后正中切口，切開(kāi)皮膚后，沿骨膜下剝離，充分顯露L1～6棘突、關(guān)節(jié)突及椎板。
咬骨鉗去除棘突、關(guān)節(jié)突、棘上、棘間韌帶，切斷雙側(cè)豎棘肌，依層縫合皮下筋膜、皮膚。
假手術(shù)組SD大鼠僅切開(kāi)皮膚后即縫合。
1.3.3 LBP藥物干預(yù)方法
LBP藥物干預(yù)組在造模后4周，每天上午8：00灌胃給藥，容量為1mL?kg-1，連續(xù)4周。
假手術(shù)組及椎間盤(pán)退變組分別灌胃給予等容量生理鹽水，連續(xù)4周。
在大鼠腰椎間盤(pán)退變模型建立8周后三組所有大鼠再次麻醉，顯露腰椎間盤(pán)，迅速取出L3～4或L4～5椎間盤(pán)組織。
1.4 光學(xué)顯微鏡下觀察
三組大鼠椎間盤(pán)組織放置于4%多聚甲醛溶液中固定24h，脫水、石蠟包埋、組織切片(厚4～5μm)，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察椎間盤(pán)髓核組織的形態(tài)學(xué)變化。
1.5 電子顯微鏡下觀察
迅速將切除的椎間盤(pán)組織先置于2%戊二醛溶液固定，2 h后，待髓核的蛋白組織徹底變性、凝固后再切取髓核組織，0.1M二甲砷酸鈉緩沖液沖洗3次，每次間隔2 h之后固定過(guò)夜。
1%鋨酸固定，乙醇、丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹(shù)脂812包埋，超薄切片經(jīng)檸檬酸鉛染色后，在日立H-600型透射式電子顯微鏡下觀察并攝片。
2 結(jié)果
2.1 光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果
2.1.1 假手術(shù)組
可見(jiàn)較多的髓核細(xì)胞和不定型的基質(zhì)，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則集中成簇，細(xì)胞質(zhì)染色深，細(xì)胞外的基質(zhì)豐富，細(xì)胞周?chē)枯^明顯，膠原纖維排列整齊，見(jiàn)圖1-A(封2)。
2.1.2 椎間盤(pán)退變組
髓核細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，細(xì)胞周?chē)|(zhì)較多，細(xì)胞含水量減少，同時(shí)出現(xiàn)大量的空泡，膠原纖維環(huán)排列紊亂，見(jiàn)圖1-B(封2)。
2.1.3 LBP藥物干預(yù)組
髓核細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的數(shù)目減少和形態(tài)變化，髓核細(xì)胞有變形、壞死 ，見(jiàn)圖1-C(封2)。
與椎間盤(pán)退變組相比，髓核細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞外基質(zhì)較多，空泡數(shù)目較少。
2.2 電子顯微鏡下觀察結(jié)果
2.2.1 假手術(shù)組
髓核細(xì)胞有突起，細(xì)胞核多呈卵圓形或圓形，核膜完整，染色體位于細(xì)胞核中央。
細(xì)胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)多并排列整齊，可見(jiàn)生長(zhǎng)良好的線粒體和高爾基體，細(xì)胞漿內(nèi)有大量的糖原顆粒，見(jiàn)圖2-A(封2)。
2.2.2 椎間盤(pán)退變組
可見(jiàn)壞死的髓核細(xì)胞，死亡的細(xì)胞外周出現(xiàn)增厚的組織，密度較高。
少見(jiàn)的髓核細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，核內(nèi)染色質(zhì)凝集，核膜不完整，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器稀少。
粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體空泡狀，線粒體腫脹、崩裂或空泡化。
嚴(yán)重者細(xì)胞器分辨不清，胞漿基質(zhì)密度加深、整個(gè)細(xì)胞體積縮小。
有的細(xì)胞呈凋亡改變，胞質(zhì)模糊不清，胞膜不完整或缺如。
細(xì)胞質(zhì)內(nèi)被大量的空泡填充，見(jiàn)圖2-B(封2)，部分細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡改變。
2.2.3 LBP藥物干預(yù)組
髓核細(xì)胞可見(jiàn)突起和皺褶，體積雖有縮小但大于造模組，細(xì)胞核有變形，染色質(zhì)出現(xiàn)排列異常，但形態(tài)較規(guī)則。
細(xì)胞器依稀可見(jiàn)，有的模糊不清，胞膜欠完整。
有的可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的線粒體，但線粒體內(nèi)嵴樣結(jié)構(gòu)觀察欠清晰。
細(xì)胞質(zhì)電子密度低的空泡明顯少于椎間盤(pán)退變組，見(jiàn)圖2-C(封2)。
3 討論
隨著我國(guó)老齡化社會(huì)的到來(lái)，機(jī)體退變性的病變?nèi)缱甸g盤(pán)退變引起的脊柱疾患日益構(gòu)成對(duì)人民健康的威脅，并嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。
采取有效的藥物或生物制劑延緩或抑制椎間盤(pán)退變的發(fā)生、發(fā)展一直是近年來(lái)脊柱外科研究的熱點(diǎn)。
椎間盤(pán)髓核細(xì)胞及纖維環(huán)在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性及修復(fù)椎間盤(pán)退變的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[6]。
本實(shí)驗(yàn)的大鼠椎間盤(pán)退變模型是通過(guò)改變脊柱生物力學(xué)，使得椎間盤(pán)穩(wěn)定性失衡，從而椎間盤(pán)出現(xiàn)退行性改變。
椎間盤(pán)的組織形態(tài)學(xué)改變與椎間盤(pán)退變發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。
實(shí)驗(yàn)證實(shí)：椎間盤(pán)退變表現(xiàn)為一系列組織形態(tài)學(xué)上的變化[3-4]。
光學(xué)顯微鏡下觀察，正常的椎間盤(pán)組織可見(jiàn)髓核細(xì)胞分布在髓核中，細(xì)胞增殖活躍，膠原纖維排列整齊。
隨著年齡的增長(zhǎng)發(fā)生漸進(jìn)性的退行性改變，表現(xiàn)為細(xì)胞減少，組織結(jié)構(gòu)紊亂的程度逐漸加重，膠原纖維增生、粗大、走行紊亂[7]。
本實(shí)驗(yàn)研究的假手術(shù)組、可見(jiàn)較多的髓核細(xì)胞和不定型的基質(zhì)，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則集中成簇，細(xì)胞外的基質(zhì)豐富，膠原纖維排列整齊。
而椎間盤(pán)退變組與上述正常椎間盤(pán)組織形態(tài)和椎間盤(pán)自然退變的形態(tài)學(xué)變化相符合。
LBP藥物干預(yù)組為髓核細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的數(shù)目減少和形態(tài)變化，髓核細(xì)胞有變形、壞死。
此組光學(xué)顯微鏡下的病理改變介于上二組之間，說(shuō)明LBP可能對(duì)椎間盤(pán)退變有延緩作用。
從根本上而言，退變椎間盤(pán)的變化在于自身細(xì)胞的功能退化、凋亡和壞死。
通過(guò)超微結(jié)構(gòu)的觀察，以明確椎間盤(pán)退變發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)程度。
正常的椎間盤(pán)組織超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為髓核細(xì)胞胞膜外有突起，核膜完整，染色體位于細(xì)胞核中央。
細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞器表現(xiàn)為大量密集的呈扁平囊狀的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及其間的一些多聚核糖體和單個(gè)核糖體。
線粒體數(shù)量多，呈板狀或管狀嵴。
膠原纖維在正常間盤(pán)排列緊密，呈波浪狀。
而發(fā)生退變的椎間盤(pán)會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的變化。
劉勇等[8]電鏡下觀察突出椎間盤(pán)組織，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胞質(zhì)中的線粒體數(shù)量少或看不清，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，嚴(yán)重退變細(xì)胞中溶酶體、空泡和微絲增多，壞死細(xì)胞中細(xì)胞器空化。
這些都是細(xì)胞功能衰退的征象，并與退變的程度相關(guān)。
Helen等[9]電鏡下觀察不同年齡階段椎間盤(pán)膠原纖維的波紋發(fā)現(xiàn)，膠原纖維在正常間盤(pán)排列緊密，呈波浪狀，而在退變間盤(pán)中排列稀疏和折皺。
本實(shí)驗(yàn)電子顯微鏡下觀察結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道比較吻合，證實(shí)了通過(guò)手術(shù)方法建立的大鼠腰椎間盤(pán)退變模型[5]椎間盤(pán)超微結(jié)構(gòu)的改變與椎間盤(pán)退變程度相關(guān)。
LBP藥物干預(yù)組為髓核細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的數(shù)目減少和形態(tài)變化，髓核細(xì)胞有變形、壞死。
此組超微結(jié)構(gòu)的病理改變介于假手術(shù)組和椎間盤(pán)退變組之間，進(jìn)一步驗(yàn)證了LBP可能具有延緩椎間盤(pán)退變的作用。
本文通過(guò)光鏡和電鏡觀察了LBP對(duì)大鼠退變的椎間盤(pán)髓核組織形態(tài)學(xué)的影響，驗(yàn)證了LBP可能有延緩或抑制椎間盤(pán)退變的作用，為尋找預(yù)防、治療椎間盤(pán)退變的藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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