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SDS研究實驗報告
一、研究背景及目的
對于那些生物體內含量高、易于分離結晶獲得純品的蛋白，可以通過測定氨基酸序列，借助各種氨基酸的分子量求出蛋白的分子量，并與質譜等手段相互結合，得到精確可信的分子量。但對于那些含量少，不易分離的蛋白，無法實現(xiàn)結晶，就必須借助其他手段測定其分子量。
要找到能夠測定分子量的實驗手段，首先要考慮那些能夠將不同分子按照其各自的分子量分離的技術。在眾多的技術當中，密度梯度離心、層析、電泳都與物質的分子量有關。其中，超速離心機造價高，使用過濾層析色譜測分子量要做標準曲線，柱長要求高，且這些方法不夠準確。因此，電泳技術成為了實現(xiàn)分子量測定這一目的的最佳選擇。
但是，在活性電泳中，影響蛋白前遷移率的因素有蛋白質的電荷性質、分子大小和形狀。要測定分子量，就要消除電荷、分子形狀對蛋白遷移率的影響，即使得各種蛋白的電荷、形狀不存在顯著差異。對于電荷，使各分子不帶電違背電泳的基本原理，而使各分子帶點完全相同是無法實現(xiàn)的，因此考慮使其帶上大量電荷，從而讓分子之間的電荷差異可以忽略。在活性電泳中，改變樣品的帶電情況依靠的是緩沖液pH的變化，顯然不能夠使分子大量帶電，這就表明必須向電泳體系中引入其他物質，與蛋白分子定量等量結合，且不改變分子量差異造成泳動差異。對于分子形狀，考慮到功能性蛋白大多是球形粒子，要保持形狀不變，就要實現(xiàn)對蛋白的包裹性結合。而蛋白表面的電荷分布情況千差萬別，依靠電荷性質無法結合形成穩(wěn)定的復合物�？紤]到蛋白質中含有大量的疏水氨基酸，可以通過疏水作用結合，這就要造成蛋白變性，是疏水基團充分暴露出來，分子不能在維持球型而變成棒狀，因此，所選擇的物質還需要能夠維持復合物形狀的統(tǒng)一�；谝陨峡紤]，科學家選擇了雙親性物質，既能通過疏水作用與蛋白定量結合成牢固的復合物，又能借助親水性在溶液中良好分散。
新技術的發(fā)明常以原有技術作為基礎。在活性電泳中，采用堿性體系，依靠濃縮效應實現(xiàn)了樣品的濃縮，大大提高了分析的精度。而變性電泳屬于全蛋白染色，結果較準確。在變性電泳中，要借助濃縮效應，就要使樣品由負極向正極遷移，那么所選擇的物質與蛋白結合之后要形成帶負電的復合物。就這樣，選擇了十二烷基硫酸鈉（SDS）作為變性劑。而且，發(fā)現(xiàn)形成的復合物成棒狀，短軸恒定，而長軸與分子量相關。所以，SDS就成為了理想的變性劑。這種方法最適宜測定分子量是15,000—100,000的樣品, 對低于10,000分子量的水解蛋白不太適用。通過改進，用強電解質離子為前導離子和拖尾離子可對分子量低于10，000的水解蛋白樣品進行分子量測定。用這種方法測定蛋白質的分子量,分辨率高，所需設備廉價，與用其他方法測得的分子量相比，誤差一般在±10%以內，因而其廣泛應用于蛋白分離純化和分子量測定。
因此，SDS-PAGE是目前常用的測定蛋白質分子量的方法。本實驗通過利用SDS-PAGE測定實驗四純化的麥清蛋白，學習和掌握SDS-PAGE測定蛋白質分子量的原理，掌握其具體操作；并與活性電泳進行對比，了解其異同，加深對電泳技術了理解。
二、實驗原理
1、聚丙烯酰胺凝膠電泳可對蛋白質的種類和數量做定性分析，帶電蛋白質分子在電場作用下將作定向移動,在其他條件( 電場、介質粘度等) 不變的情況下, 蛋白質在凝膠中的遷移速率受分子所帶凈電荷量與分子大小、形狀等因素的影響。如果兩種不同分子量的蛋白質的分子大小的差異被所帶凈電荷量的差異所補償時,則這兩種不同分子量的蛋白質可以相同的速率電泳,無法通過電泳距離測定蛋白質的分子量。因而要測定分子量則需要蛋白質以分子量為唯一變量進行泳動，即需要引入某種物質與蛋白結合消除凈電荷和分子形狀的影響。
由于變性電泳由活性電泳發(fā)展而來，濃縮效應是在堿性體系下建立的，在此體系下蛋白質帶負電，又由于蛋白質的等電點普遍低于7，在堿性體系下不同蛋白質所帶電荷量不同，自身差異更大，分離效果更好。因而要引入的這一能消除蛋白質自身所帶凈電荷的物質在電泳體系下應帶負電荷。另一方面，我們要引入的物質應能與蛋白質普遍穩(wěn)定地定量結合，結合后不同分子量的多肽鏈形狀類似，使各多肽鏈間的差別集中在分子量上。
通過試驗與實踐，人們找到了一種雙親性物質即SDS，SDS是十二烷基硫酸鈉的簡稱，是一種很強的陰離子表面活性劑，SDS以其疏水基和蛋白質分子的疏水區(qū)相結合，形成牢固的帶負電荷的蛋白質-SDS復合物，由于SDS的結合，所引入的凈電荷大約為蛋白質本身凈電荷的10倍，使SDS-蛋白質復合物所帶電荷遠遠超過蛋白質原有的凈電荷，從而消除或大大降低不同蛋白質之間所帶凈電荷的不同對電泳遷移率的影響。在分子形狀方面，SDS-蛋白質復合物具有扁平而緊密的橢圓形或棒狀結構，棒的短軸是恒定的，在18A數量級，與蛋白質種類無關，棒的長軸是變化的，其變化正比于蛋白質分子量。說明SDS和蛋白質結合所形成的SDS-蛋白質復合物消除了由天然蛋白質形狀的不同而對電泳遷移率的影響。
2、在SDS的存在下，蛋白質在電場中泳動時其遷移率僅與蛋白質分子質量有關。二者的關系式為：lgM=ab
其中，M為相對分子質量，Rm為相對遷移率——蛋白質在凝膠中的遷移距離與指示劑前沿距離的比值，a、b為常數。從上式可知，蛋白質分子質量的對數與蛋白質遷移率呈線性負相關。在同一塊電泳凝膠上對一組已知分子量的標準蛋白質和蛋白樣品分別進行SDS-PAGE分析，以標準蛋白的遷移率為橫坐標，以分子質量的對數為縱坐標繪制標準曲線，從未知蛋白質的遷移率即可求出蛋白質亞基的分子質量。
三、儀器與試劑
實驗材料：實驗四麥清蛋白脫鹽樣品
實驗試劑：三羥甲基氨基甲烷（Tris）；丙烯酰胺（Acr）；甲叉雙丙烯酰胺（Bis）；十二烷基硫酸（SDS）；N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）；過硫酸銨；甘油；巰基乙醇；異丙醇；溴酚藍；考馬斯亮藍R-250；甘氨酸；鹽酸；乙酸；冰乙酸。
實驗儀器：直流穩(wěn)壓電源（600V，100mA）；移液器；燒杯（50ml×2）；實驗儀器：DYY-Ⅲ2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京市六一儀器廠）；DYY-III2電泳槽（北京市六一儀器廠）；微量進樣器50μl（上海安亭微量進樣器廠）；大培養(yǎng)皿一套。
試劑配制：
實驗儀器：DYY-III2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀一套（北京市六一儀器廠）、燒杯50ml×3，微量進樣器（上海安亭微量進樣器廠）、大培養(yǎng)皿一套、微量可調手動移液器（大龍）。
四、實驗方法
1、貯液配制（教師完成）
按照實驗指導43頁配制貯液，注意：配好的丙膠貯液盛于棕色瓶中置冰箱中保存，可放1~2個月；過硫酸銨和染色液應當天配制；電極緩沖液用時稀釋10倍；如有不容物應當過濾。
2、凝膠的制備
�。�1）將貯液由冰箱取出，待與室溫平衡后再配制工作液。
（2）安裝電泳槽。安裝時，注意旋緊螺絲時要均衡用力，以免夾碎玻璃片。
（3）用2%瓊脂封底，以防漏膠。
�。�4）按下表所示配制分離膠
在小燒杯中混勻后，立即灌膠。灌膠時，將電泳槽稍傾斜，用手扶穩(wěn)，將小燒杯尖端抵在長玻璃片頂端，小心將溶膠倒入兩玻璃片之間，灌至據短玻璃片頂端2cm左右即可，放平電泳槽，立即用滴管在膠的上層小心輕緩地覆蓋2~3mm的水層。灌注水層是要均勻輕緩，以防在膠頂部產生漏洞，影響結果，剛加水時，可以看出界面，后逐漸消失；等到再出現(xiàn)界面時，表明分離膠已經聚合，再靜置一會兒，將水倒出，用濾紙條從一側略微吸浸，注意不要碰毀膠面，準備灌注濃縮膠。
�。�5）按下表配制濃縮膠
混勻后立即灌膠，操作同上，至膠面與短玻璃片頂端平齊，立即插入樣品槽模板（梳子）。聚合完成后，在電泳槽內倒入電極緩沖液，使短玻璃片一側電極緩沖液沒過玻璃片頂端，長玻璃片一側電極緩沖液沒過電極絲，然后小心拔出梳子，準備點樣。
3、樣品的處理
Marker：市售標準樣品按要求制備。
待測樣品：麥清蛋白初步提取的凝膠過濾脫鹽實驗所獲峰值管制備的SDS-PAGE樣品。 所有樣品于沸水浴中加熱5min，冷卻后上樣。
上樣量：Marker 20μl，待測樣品4μl、10μl、20μl、30μl、50μl。
4、電泳
接好電源線（上槽接負極，下槽接正極）。打開電源開關，調節(jié)電流，初始時控制在15mA左右，當前沿進入分離膠后，可調節(jié)電流到25mA左右。實驗中溴酚藍前沿指示劑不能跑丟。
5、檢測
電泳結束后，取出膠板，現(xiàn)在水中浸泡10min，以浸出部分SDS，然后把膠板轉到染色液中過夜，將蛋白質固定并染色（或加熱2h，在通風櫥中操作）。然后用脫色液脫至條帶清楚，觀察記錄結果。
6、測定蛋白質樣品的遷移率和未知樣品的分子量
用卡尺或坐標精確測量溴酚藍和各種蛋白質遷移的距離，記溴酚藍遷移的距離為d1，蛋白質遷移的距離為d2，根據下面的公式計算出各種蛋白質的遷移率Rm：Rm=d2/d1。
以標準蛋白的遷移率為橫坐標，以其對應的分子量的對數值為縱坐標作圖。然后給句待測樣品的遷移率，在圖上查出其對應的分子量。并由所得結果分析實驗四麥清蛋白初步提取的實驗效果以及后續(xù)進一步分離純化的方案。
五、數據整理及結果計算與討論及分析
（一）結果計算與分析
以marker蛋白的遷移率Rm為橫坐標，對應蛋白分子量的對數為縱坐標，做出本次實驗的SDS-PAGE分子質量測定標準曲線。
有上可得，標準曲線的方程為y = -1.1355x + 5.0731。其R2 = 0.9639，曲線可用。將麥清蛋白的相對遷移率0.2287帶入曲線方程，得到其分子量的對數為4.8134，則其分子量為65072Da，約為65.1kDa。
（二）討論
本次實驗與上次的活性電泳不同，除了跑在最前面的溴酚藍前沿，還有一個蛋白前沿。蛋白前沿的產生是因為在實驗中有些蛋白降解為較短的小肽段，分子量僅比溴酚藍大一些，遷移速度超出了其他蛋白，且在膠板中發(fā)生側向擴散，形成蛋白前沿。同時，靠近蛋白前沿的部分有大量分子量較小的蛋白樣品聚集，它們并非我們需要 品，因為分離膠不夠長而沒有分開。
本次實驗我組順利的將marker的七條帶均勻跑開并顯現(xiàn)出來，說明這次實驗中我組在操作上基本無大的問題。對于最后一條marker帶出現(xiàn)上翹情況，經與老師分析討論后，認為對于偏向下部的條帶尤其是靠近底部的條帶，會受到膠板邊緣效應的影響，會發(fā)生偏折。因此在今后的實驗操作中，對于這種情況，應避免使用此處的marker進行計算。
我們指定了靠近Marker第二條帶的一條顏色很深的條帶作為目標蛋白，這是因為這一蛋白含量相對較高，與其他蛋白明顯分離開來。通過上面的計算，得到這種蛋白的相對分子質量為65.1kDa。
在對Marker進行作圖的時候，我們發(fā)現(xiàn)116.0kDa的條帶并不在直線上，其遷移的距離明顯超過了應有的遷移距離，說明在電泳過程中這個蛋白遷移速度過快�？紤]到其他條帶的遷移正常，我們認為可能的原因有兩個：一是Marker本身的質量問題，標稱116.0kDa的蛋白分子量不足116.0kDa；二是凝膠組成的問題。實驗中所用的凝膠孔徑過大，導致凝膠對分子量最大的標準蛋白的阻礙作用不足，使這個蛋白遷移速度超出了本來應有的速度。
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