醫(yī)學(xué)專業(yè)研究白血病課題畢業(yè)論文

　　1 材料

　　白花蛇舌草由江西藥都樟樹(shù)中藥飲片有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20080701。將白花蛇舌草高速粉碎成碎片狀，浸泡于盛有10倍量藥材的蒸餾水的圓底燒瓶中12 h后，煎煮3次，收集濾液進(jìn)行抽濾濃縮，將濃縮液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，濾液蒸發(fā)成粉末，再將粉末準(zhǔn)確稱重并溶于三蒸水，濾過(guò)除菌，配成濃度為220 mg/ml的白花蛇舌草水提液備用。噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）為Sigma公司產(chǎn)品，RPMI1640為Gibco公司產(chǎn)品，小牛血清（FBS）為杭州四季青生產(chǎn)，凋亡檢測(cè)試劑盒為北京保賽生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

　　2 方法

　　2.1 細(xì)胞培養(yǎng)白血病CEM細(xì)胞株本實(shí)驗(yàn)室保存。培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS的RPMI1640，并加入雙抗（青霉素100 U/ml和鏈霉素100μg/ml）。在37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱（Therno Forma公司產(chǎn)品）中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

　　2.2 MTT比色實(shí)驗(yàn)將CEM細(xì)胞懸液離心（1 500 r/min、8 min），臺(tái)朌藍(lán)拒染法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞終濃度為3×105/ml進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔190 μl，24 h后，實(shí)驗(yàn)組分別加入6種不同濃度的白花蛇舌草溶液（終濃度分別為0.005 12，0.025 6，0.128，0.64，3.2，16 μg/ml）10 μl，對(duì)照組不加藥，微振蕩，另設(shè)空白組（只有培養(yǎng)基，無(wú)細(xì)胞）每組6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)于3個(gè)時(shí)間段（24，48，72 h）后，每孔加MTT（5 mg/ml）20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心（1 500 r/min、8 min），棄上清液，每孔加DMSO 150 μl，避光微振蕩，讓甲臜溶解充分，置于自動(dòng)酶標(biāo)儀，測(cè)490 nm處的吸光度（A490）值。抑制率（%）=［（對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值）/對(duì)照組A值］×100%。

　　2.3 形態(tài)學(xué)觀察白花蛇舌草作用于CEM細(xì)胞時(shí)間和濃度同MTT比色實(shí)驗(yàn)，在倒置顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組CEM細(xì)胞的一般情況并照像；CEM細(xì)胞懸液離心涂片，Giemsa染色，油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；取白花蛇舌草3個(gè)濃度（0.025 6，0.128，0.64 μg/ml）作用于CEM細(xì)胞，兩個(gè)時(shí)間段（24，48 h）后，制成超薄切片，在透視電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及凋亡小體。

　　2.4 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）分析白花蛇舌草3個(gè)濃度（0.025 6，0.128，0.64 μg/ml），作用于CEM細(xì)胞兩個(gè)時(shí)間段（24，48 h）后，細(xì)胞用PBS洗兩遍，70%乙醇固定，重懸于PBS中調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，取100 μl，加碘化吡啶（PI）1 ml，輕輕混勻置4℃冰箱30 min，上機(jī)檢測(cè)（流式儀為 BECTON DTCKINSON，B.D公司產(chǎn)品），采用CenQuest軟件上機(jī)獲取10 000個(gè)細(xì)胞，ModFitlt軟件分析并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

　　3 結(jié)果

　　白花蛇舌草對(duì)白血病CEM細(xì)胞生長(zhǎng)的影響不同時(shí)間和劑量白花蛇舌草對(duì)CEM細(xì)胞生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表1。0.025 6 μg/ml的白花蛇舌草即可顯著抑制CEM細(xì)胞生長(zhǎng)，半數(shù)抑制濃度（IC50）約為0.128 μg/ml，從表1可見(jiàn)，白花蛇舌草對(duì)CEM細(xì)胞的抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴性，抑制率隨劑量增高、時(shí)間延長(zhǎng)而增大。

　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白花蛇舌草處理白血病CEM細(xì)胞后，能顯著抑制其生長(zhǎng)。抑制率具有時(shí)間和劑量依賴性，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，藥物劑量的增大，抑制率逐步提高。光鏡顯示，細(xì)胞體積縮小，核濃染，細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組比較大為減少。電鏡證明，形態(tài)學(xué)呈現(xiàn)典型的凋亡特征性改變，核染色質(zhì)凝集，沿核膜周邊聚集呈新月形，胞膜內(nèi)陷包裹變性的細(xì)胞內(nèi)容物成凋亡小體，這些變化是確認(rèn)細(xì)胞凋亡的十分可靠的方法［5］。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步說(shuō)明白花蛇舌草能誘導(dǎo)CEM細(xì)胞凋亡。

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