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參環(huán)毛蚓體內(nèi)核苷磷酸化酶的活性測定及動(dòng)力學(xué)分析論文
參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum(E. Perrier)屬鉅蚓科動(dòng)物，藥材習(xí)稱“廣地龍”，是《中華人民共和國藥典》收載的 4 種來源動(dòng)物中品質(zhì)最優(yōu)者。在廣地龍入藥的四千多年歷史中，其平喘作用為臨床常用。由于次黃嘌呤及黃嘌呤是目前已知地龍平喘作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，次黃嘌呤的存在與否及含量高低自然成為評(píng)價(jià)廣地龍平喘藥效的重要指標(biāo)性成分。迄今為止，參環(huán)毛蚓體內(nèi)次黃嘌呤的合成代謝途徑研究尚屬空白，無法了解次黃嘌呤如何生成及影響和控制其產(chǎn)量與代謝方式的因素。眾所周知，酶是細(xì)胞內(nèi)生物化學(xué)反應(yīng)的催化劑，其存在與否及活性的高低直接影響產(chǎn)物的形成和產(chǎn)量。據(jù)此，本研究借鑒國外相關(guān)研究成果，以次黃嘌呤代謝過程中產(chǎn)生重要作用的嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)為主要研究對(duì)象，構(gòu)建能快速準(zhǔn)確檢測參環(huán)毛蚓體內(nèi) PNP 酶活性的方法，考察該酶活性效應(yīng)及其作用規(guī)律，為進(jìn)一步確認(rèn)及探究參環(huán)毛蚓體內(nèi)嘌呤合成代謝途徑，解析其調(diào)控機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1儀器及試劑 P680A LPG 高效液相色譜系統(tǒng)、ASI-100 自動(dòng)進(jìn)樣器、UVD170U 紫外檢測器，美國戴安公司;TL-18M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海市離心機(jī)械研究所有限公司;TG16-W 微量高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;SG8200HE 超聲波清洗機(jī)，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司;BP211D 十萬分之一精密電子天平，德國賽多利斯公司。
1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 樣本采自廣東省廣州市番禺區(qū)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)李薇教授鑒定為鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓Pheretima asperfillum(E.Perrier)。選擇體型健碩、活力較強(qiáng)、性成熟、體表具有明顯生殖環(huán)帶、平均濕質(zhì)量約 14.1 g 的健康成蚓，經(jīng)無菌超純水清洗后，放入鋪有濕潤滅菌濾紙的塑料箱中，在室溫(22±2)℃下，避光培養(yǎng) 48 h 以備用。
1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與樣品處理
1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精密稱取肌苷標(biāo)品 3.88 mg，次黃嘌呤標(biāo)品 2.51 mg，分別置于 2 mL 量杯中，用 PBS緩沖液溶解并定容至 10 mL 的容量瓶，均稀釋為 500滋mol·L-1作為母液，置于 4 ℃冰箱中備用。
1.3.2參環(huán)毛蚓粗蛋白的制備 解剖活體參環(huán)毛蚓，去除腸道后剪取體壁組織用 PBS 緩沖液浸泡潤洗 3次，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿剪碎后用勻漿器研磨，以 0.1 mo·lL-1pH7.4 的 PBS 緩沖液為溶劑，將組織液轉(zhuǎn)移至離心管，4℃ 12000 r·min-1離心 30 min，將提取液分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆�。以小牛血清蛋�?BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品，采用 Bradford 法測定粗蛋白含量。
1.4色譜條件 采用 Ecosil C18-AQ 柱 (250 mm×4.6mm，5滋m)，流速為 0.8 mL·min-1，柱溫為室溫，檢測波長為 254 nm。流動(dòng)相 A 為 10 mmol·L-1磷酸二氫銨緩沖液，用磷酸調(diào) pH 至 4.5，B 為 10 %甲醇。采用梯度洗脫：0～10 min A-B(50∶50)，10～15 minA-B (20∶80)，15～25 min A-B (0∶100)，25～35min A-B(0∶100)。
2結(jié)果
2.1方法學(xué)考察結(jié)果
2.1.1方法專屬性 在優(yōu)化的色譜條件下，肌苷峰型良好，與代謝產(chǎn)物分離良好。
2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與檢測限 取次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)液，用 PBS 緩沖液稀釋成 0.5，2，4，5，10，15，20，40滋mol·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)液，取 10滋L 按色譜條件進(jìn)行 HPLC 分析，測定次黃嘌呤含量(n=5)。以次黃嘌呤峰面積Y為縱坐標(biāo)，次黃嘌呤濃度(X，滋mol·L-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明次黃嘌呤在0.5~40滋mol·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=0.0653X-0.0394，r=0.9996。次黃嘌呤檢測限為 0.05滋mol·L-1(S/N≥3)。
2.2肌苷在參環(huán)毛蚓組織粗蛋白中的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)
2.2.1蛋白濃度考察 為了考察參環(huán)毛蚓體壁組織酶反應(yīng)體系中合適的蛋白濃度，以不同蛋白濃度(X)與產(chǎn)物次黃嘌呤的濃度增加量繪制曲線。結(jié)果表明樣品的蛋白濃度在 0～7.5 mg·mL-1范圍內(nèi)，與產(chǎn)物濃度變化量呈線性關(guān)系，因此在該濃度范圍內(nèi)的廣地龍粗蛋白提取物可用于酶活性分析。
2.2.2孵育時(shí)間考察 為了考察適當(dāng)?shù)牡姆跤龝r(shí)間，以產(chǎn)物濃度與孵育時(shí)間繪制曲線，結(jié)果見圖 3。在0～30 min 的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，酶促反應(yīng)呈線性上升，而30 min 后，酶活力基本穩(wěn)定，說明酶促反應(yīng)已完成，處于穩(wěn)定狀態(tài)，故選用孵育時(shí)間 30 min 作為酶活力測定的時(shí)間。
3討論
在酶活性的檢測方法中，高效液相色譜法因其靈敏度高、選擇性好而應(yīng)用廣泛，尤其是對(duì)目標(biāo)成分的檢測能做到快速、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)的特點(diǎn)，更受國內(nèi)外學(xué)者的歡迎。本研究參考了文獻(xiàn)有關(guān) HPLC 方法，并以此為基礎(chǔ)對(duì)流動(dòng)相的比例、梯度洗脫條件進(jìn)行了改進(jìn)及優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了底物與產(chǎn)物之間的良好分離。
對(duì)酶活性的測定是通過檢測單位時(shí)間、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來實(shí)現(xiàn)的，即測定酶反應(yīng)的速度。而酶反應(yīng)速率受蛋白濃度和反應(yīng)時(shí)間影響，只有當(dāng)反應(yīng)速率與蛋白濃度及孵育時(shí)間均顯線性關(guān)系時(shí)，才是酶活性的真實(shí)表現(xiàn)。因此，本研究考察了酶反應(yīng)體系所需的最佳蛋白濃度和孵育時(shí)間。首次建立了參環(huán)毛蚓體內(nèi)次黃嘌呤代謝酶活性測定相關(guān)的實(shí)驗(yàn)體系，為進(jìn)一步研究平喘有效物質(zhì)的代謝途徑及其調(diào)控機(jī)制提供了良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
鑒于國外有研究學(xué)者已從寄生蟲和哺乳類動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn) PNP 是主導(dǎo)次黃嘌呤生成的關(guān)鍵酶。因此，本研究選取了 PNP 作為研究對(duì)象。此外，與嘌呤合成代謝途徑相關(guān)的酶還有腺苷脫氧酶(ADA)和黃嘌呤氧化酶(XO)。本實(shí)驗(yàn)除了 PNP 外，還利用上述實(shí)驗(yàn)體系對(duì) ADA 和 XO 也進(jìn)行了酶活性分析，獲得相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。此研究結(jié)果與國外已報(bào)道的人紅細(xì)胞、寄生蟲等嘌呤合成代謝途徑關(guān)鍵酶活性的結(jié)果頗為一致。由此，提示參環(huán)毛蚓體內(nèi)有可能也存在類似嘌呤合成代謝途徑。
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