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消瘤片水提工藝
消瘤片水提工藝【1】
【摘要】 目的優(yōu)選消瘤片水提工藝。
方法以咖啡酸含量、總多糖含量和浸膏得率為指標(biāo)，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)， 對(duì)加水倍量、提取時(shí)間、提取次數(shù)等因素進(jìn)行考察，以確定最優(yōu)提取工藝。
結(jié)果較優(yōu)工藝為加水14倍量，回流提取3次，每次1 h。
結(jié)論優(yōu)選得到的消瘤片水提工藝穩(wěn)定、可行。
【關(guān)鍵詞】 咖啡酸; 總多糖; 單因素實(shí)驗(yàn); 正交試驗(yàn)
消瘤片為新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院婦科長(zhǎng)期臨床實(shí)踐的經(jīng)驗(yàn)方,其主要功效為活血化瘀、攻堅(jiān)消瘤。
為方便患者使用，本課題組擬采用先進(jìn)的技術(shù)和工藝，將其制成片劑-消瘤片。
根據(jù)各味藥材的主要有效成分和理化性質(zhì)，對(duì)方中蒲公英、茯苓等7味藥用水提取，其中咖啡酸為蒲公英的主要有效成分，茯苓等藥材主要含有多糖類(lèi)成分。
因此，本研究以咖啡酸、多糖為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選其水提工藝，現(xiàn)報(bào)道如下。
1儀器與試藥
1.1儀器Waters 2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司),Cintra20紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(GBC科技儀器有限公司),AL204電子天平、AG135電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]，SK3300LH超聲清洗器(上�？茖�(dǎo)超聲儀器有限公司)，Direct QTM5超純水儀(Millipore Corporation, Bedford, MA, U.S.A.)。
1.2試藥咖啡酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110885-200102，供含量測(cè)定用)，葡萄糖對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110833-200503，供含量測(cè)定用)，甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，試驗(yàn)中其它試劑均為分析純。
茯苓、蒲公英等7味藥材由新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院提供，經(jīng)檢驗(yàn)均符合《中國(guó)藥典》2010年版一部項(xiàng)下規(guī)定。
2方法與結(jié)果
2.1HPLC法測(cè)定咖啡酸含量
2.1.1色譜條件色譜柱 SYMMETRY C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.4%磷酸(22∶2∶76)，檢測(cè)波長(zhǎng)323 nm，柱溫30℃，流速1.0 ml/min，進(jìn)樣量15 μl。
2.1.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取咖啡酸對(duì)照品3.30 mg，加甲醇適量溶解并定容至 10 ml量瓶中,定容至刻度，搖勻。
精密吸取1 ml置10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。
再精密吸取2 ml置25 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻,作為貯備液。
2.1.3供試品溶液的制備及測(cè)定稱取該處方各味藥材適量，加一定量水回流提取一定時(shí)間，待藥液冷卻至室溫后濾過(guò)，精密移取4 ml置10 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，離心，取上清液經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾后，取15 μl注入高效液相色譜儀測(cè)定，供試品溶液高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。
圖1供試品溶液高效液相色譜圖
2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密吸取貯備液1、2、3、4、5 ml，置于5 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)溶液。
取上述5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾后，各取15 μl注入高效液相色譜儀測(cè)定。
以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得回歸方程為：Y =79 202 X-8 895.9,相關(guān)系數(shù)r=0.999 2。
結(jié)果顯示咖啡酸在0.528～2.64 μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。
對(duì)照品溶液高效液相色譜圖見(jiàn)圖2。
圖2對(duì)照品溶液高效液相色譜圖
2.1.5日內(nèi)、日間精密度試驗(yàn)取同一對(duì)照品溶液15 μl在同一天內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次，并連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算日內(nèi)及日間精密度。
結(jié)果日內(nèi)精密度RSD=0.78%，日間精密度RSD=1.64%，表明本方法精密度良好。
2.1.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液15 μl，按0、2、4、6、12、24、48 h 間隔進(jìn)樣。
測(cè)得咖啡酸的峰面積RSD=0.83%，表明供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.1.7重復(fù)性試驗(yàn)取供試品6份，按2.1.3項(xiàng)下方法制備供試液，分別精密吸取15 μl進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。
結(jié)果RSD=1.73%。
表明該方法重復(fù)性良好。
2.1.8加樣回收率試驗(yàn) 取2.1.3項(xiàng)下一定量經(jīng)測(cè)定已知含量的供試品溶液，加入不同量的咖啡酸對(duì)照品溶液，制備成 高、中、低濃度的各3份樣品，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定。
結(jié)果平均加樣回收率為100.34%，RSD=1.17%(n=9)。
2.1.9陰性對(duì)照試驗(yàn)精密稱取處方中水提部分除蒲公英外的6味藥材，按照2.1.3項(xiàng)下的方法制備缺蒲公英的陰性對(duì)照 溶液。
用高效液相色譜法測(cè)定，進(jìn)樣量15 μl。
結(jié)果表明，消瘤片處方中水提部分中其余藥材對(duì)咖啡酸的含量測(cè)定無(wú)干擾。
陰性對(duì)照溶液高效液相色譜圖見(jiàn)圖3。
圖3陰性對(duì)照溶液高效液相色譜圖
2.2紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定總多糖含量
2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品11.32 mg至10 ml量瓶中，加水定容至刻度，搖 勻。
再取2.5 ml置25 ml量瓶中，加水定容至刻度搖勻，得濃度為 0.113 2 mg/ml 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。
2.2.2供試品溶液的制備方法稱取處方中水提藥材，加適量水加熱回流一定時(shí)間，精密移取濾液1 ml置100 ml量瓶中，定容至刻度，即得。
2.2.3最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液和2.2.2項(xiàng)下樣品溶液各0.4 ml于10 ml具塞試管中，加水至2 ml，分別加入1 ml 5%苯酚溶液和5 ml濃硫酸，迅速搖勻，放置5 min，置沸水浴中加熱20 min，取出迅速冷卻至室溫。
另取2.0 ml蒸餾水同前加入試劑操作，作空白對(duì)照，在400～800 nm波長(zhǎng)處掃描。
結(jié)果顯示葡萄糖對(duì)照品溶液和供試品溶液經(jīng)顯色后均在487 nm處有最大吸收。
2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液各0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml于10 ml具塞試管中，同2.2.3項(xiàng)下操作，測(cè)定吸收值。
以吸光度(Y)對(duì)葡萄糖濃度(X)進(jìn)行回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.011 1 X-0.015，r=0.9955，表明葡萄糖濃度在22.64～67.92 μg/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線形關(guān)系。
2.2.5精密度試驗(yàn)同時(shí)精密吸取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液2 ml、標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液 0.4 ml，照2.2.3項(xiàng)下操作，連續(xù)測(cè)定5次吸收值。
結(jié)果供試品及標(biāo)準(zhǔn)品RSD分別為0.11%、0.16%，表明本方法精密度良好。
2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液2 ml，照2.2.3項(xiàng)下操作，顯色后放置30、45、60、85、100、125、150、180、240 min時(shí)分別測(cè)定吸光度。
對(duì)4 h內(nèi)顯色穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。
測(cè)定結(jié)果RSD=1.98%，表明供試品溶液顯色后在4 h內(nèi)吸光度穩(wěn)定。
2.2.7重復(fù)性試驗(yàn)精密吸取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液2 ml，共6份，測(cè)定吸收值。
結(jié)果RSD=2.49%，表明該法重復(fù)性良好。
2.2.8加樣回收率試驗(yàn)取2.2.2項(xiàng)下經(jīng)測(cè)定已知含量的供試品溶液0.3 ml，加入不同量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制備成高、中、低濃度的各3份樣品，按2.2.3項(xiàng)下操作，測(cè)定吸光度。
結(jié)果平均加樣回收率為100.44%，RSD=2.61%(n=9)。
2.3提取工藝篩選[1-3]
2.3.1因素水平的確定以咖啡酸含量、總多糖含量及水提液的浸膏得率為考察指標(biāo)，采用綜合評(píng)分法，權(quán)重系數(shù)分別 為50、30、20，滿分為100。
綜合評(píng)分=(咖啡酸含量/最大咖啡酸含量)×50+(多糖含量/ 最大多糖含量)×30+(最小浸膏得率/浸膏得率)×20根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇L9(34)正交表，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，具體見(jiàn)表1。
表1因素水平表
2.3.2正交試驗(yàn)精密稱取消瘤片處方中用水提取的藥材，按以下正交試驗(yàn)表安排實(shí)驗(yàn)(每個(gè)實(shí)驗(yàn)同時(shí)做3個(gè)平行樣)，分別測(cè)定咖啡酸含量、總多糖含量、浸膏得率，并進(jìn)行綜合評(píng)分。
直觀分析結(jié)果可知，RC>RB>RA，即對(duì)提取影響大小順序?yàn)镃>B>A，最佳提取工藝為A3B3C3，見(jiàn)表2。
表2正交試驗(yàn)結(jié)果
2.3.3方差分析結(jié)果 對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，提取次數(shù)對(duì)該方的提取效果有顯著性影響(P<0.05)，提取時(shí)間和加水倍數(shù)對(duì)提取效果均無(wú)顯著性影響。
結(jié)合工業(yè)大生產(chǎn)，從節(jié)約成本的角度考慮，確定較優(yōu)提取工藝為A1B1C3，即14倍量水，回流提取3次，每次1 h，見(jiàn)表3。
表3方差分析
2.3.4驗(yàn)證試驗(yàn)精密稱取處方中用水提取的藥材3份，按A1B1C3回流提取得樣品溶液，分別測(cè)定咖啡酸含量、總多糖含 量、浸膏得率，并計(jì)算綜合評(píng)分(表4)。
結(jié)果表明，本試驗(yàn)確定的消瘤片水提工藝穩(wěn)定、可行、合理。
表4正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果
3結(jié)論
3.1測(cè)定咖啡酸含量時(shí)，在確定供試品溶液的HPLC色譜條件時(shí)，考察了藥典方法[4]、甲醇-水、甲醇-磷酸水、乙腈-磷酸水等，結(jié)果樣品峰與雜質(zhì)峰未能有效分離。
經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，在流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.4%磷酸(22∶2∶76)時(shí)，咖啡酸峰與其他組分色譜峰能較好地分離，空白對(duì)照亦無(wú)干擾，且峰形較好。
經(jīng)方法學(xué)研究結(jié)果表明，本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為本方水提工藝中咖啡酸的含量測(cè)定用。
3.2咖啡酸、多糖為本方的主要有效成分，根據(jù)它們對(duì)療效的影響程度，確定咖啡酸權(quán)重系數(shù)為50，多糖權(quán)重系數(shù)為 30，并確定浸膏得率權(quán)重系數(shù)為20，滿分為100。
3.3本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)及正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)最終確定14倍量水，回流提取3次，每次1 h的方法為最優(yōu)工 藝。
優(yōu)選得到的消瘤片水提工藝簡(jiǎn)易、穩(wěn)定、可行，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的依據(jù)。
【參考文獻(xiàn)】
[1]譚紅勝,夏興華,楚生輝.正交試驗(yàn)法優(yōu)選蒲公英水提工藝[J].中藥材,2004,27(3):211-212.
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[3]張西如,姜建國(guó).正交試驗(yàn)研究蒲公英注射液的提取工藝[J].中成藥,2007,29(7):1075-1077.
[4]中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010:331.
宮瘤消片提取工藝【2】
[摘要] 目的：確定宮瘤消片最佳水提取工藝,為該制劑開(kāi)發(fā)成中藥新藥提供依據(jù)。
方法：以芍藥苷的提取量和浸膏得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選仙鶴草、牡蠣、土鱉子、黨參、白術(shù)、吳茱萸、白花蛇舌草水提方法。
結(jié)果：取其白花蛇舌草等七味加水煎煮2次，第1次加12倍量水，煎煮1.5 h;第2次加10倍量水，煎煮1 h。
結(jié)論：本法經(jīng)濟(jì)、合理、可行。
[關(guān)鍵詞] 宮瘤消片;芍藥苷;提取方法;正交試驗(yàn)
子宮肌瘤是女性生殖器官最常見(jiàn)的良性腫瘤，由平滑肌和結(jié)締組織組成，故又稱子宮平滑肌瘤。
常見(jiàn)于30～50歲婦女，40～50歲為高峰年齡組，20歲以下少見(jiàn)。
目前對(duì)于子宮肌瘤的治療方法，仍以子宮切除術(shù)占首位。
因此，對(duì)于未婚、未育及希望保留正常月經(jīng)功能者，具有抗感染作用的口腔藥物的研制一直受到人們的廣泛重視。
宮瘤消片是以牡丹皮、香附(制)、三棱、莪術(shù)、仙鶴草、牡蠣、土鱉子、黨參、白術(shù)、吳茱萸、白花蛇舌草經(jīng)提取制成的中藥制劑。
本文以芍藥苷的含量和浸膏得率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選宮瘤消片的最佳水提方法，為該制劑開(kāi)發(fā)成中藥新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[1-2]。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國(guó))：Agilent 1100泵、Agilent 1100 DAD檢測(cè)器、Agilent 1100色譜工作站;Sartorius BP211D電子天平(感量0.l mg、0.0l mg);USC-502超聲波清洗器。
1.2試藥
芍藥苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110736-200526);宮瘤消片(自制)，甲醇(色譜純，天津市四有生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)，乙腈(色譜純，天津市四有生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)，其他試劑均為分析純。
2 方法與結(jié)果
2.1 方法學(xué)考察
2.1.1 色譜條件
試驗(yàn)參照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局宮瘤消膠囊標(biāo)準(zhǔn)，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;乙腈-0.1% 磷酸溶液(15∶85)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm。
流速：1.0 ml/min，柱溫：30℃，以Agilent-C18柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)為分析柱，進(jìn)行試驗(yàn)研究，結(jié)果芍藥苷與樣品中其他組分色譜峰可基線分離，芍藥苷與其相鄰色譜的分離度大于1.5;按芍藥苷峰計(jì)算，理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。
2.1.2 對(duì)照品溶液的制備
取芍藥苷對(duì)照品適量，用甲醇溶解并制成每毫升含0.1 mg的溶液，即得。
2.1.3 供試品溶液的制備
取本品10片，研細(xì)，取1.163 9 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇20 ml，密塞，稱定重量，超聲處理20 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。
2.1.4 線性關(guān)系考察
分別精密吸取對(duì)照品溶液2、4、6、8、10 μl，按正文色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1。
以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程，結(jié)果表明芍藥苷進(jìn)樣量在0.2～1.0 μg范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。
回歸方程為Y=1 050.2X+44.93(r=0.999 2)，見(jiàn)圖1。
表 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果
Tab.1 The result of standardized curve
圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線
Fig.1 Standardized curve
2.1.5 精密度試驗(yàn)
取本品(批號(hào)：050601)20片，研細(xì)，稱取粉末1.163 g，精密稱定，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μl，連續(xù)進(jìn)樣5次，供試品峰面積平均值為336.88，RSD=1.42%，結(jié)果表明精密度良好。
2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)
取本品(批號(hào)：050601)20片，研細(xì)，稱取5份，各1.163 g，精密稱定，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定色譜峰面積，含量平均值為0.486 7 mg/g，RSD=1.29%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。
2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取本品(批號(hào)：050601)20片，研細(xì)，稱取粉末1.163 g，精密稱定，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在制備樣品后的0、2、4、8，12 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得芍藥苷峰面積的平均值為330.46，RSD=1.21%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.1.8 回收率試驗(yàn)
精密稱取已知含量的樣品(批號(hào)：050601，含量：0.553 8 mg/g)5份，分別精密加入對(duì)照品溶液1 ml，濃度為0.1 mg/ml，按上述條件依法測(cè)定。
本法平均回收率為99.26%，RSD=1.65%，表明回收率的重現(xiàn)性較好。
結(jié)果見(jiàn)表2。
2.1.9 樣品含量測(cè)定
按上述芍藥苷測(cè)定方法對(duì)十批中試及試生產(chǎn)成品的芍藥苷含量進(jìn)行了測(cè)定，每批平行測(cè)定2次，結(jié)果見(jiàn)表3。
表 3 樣品含量測(cè)定結(jié)果
Tab.3 Content determination results of samples
2.2 提取方法的篩選
2.2.1 因素水平的確定
以芍藥苷含量和出膏率為指標(biāo)，重點(diǎn)考察提取溶媒的用量、提取次數(shù)和提取時(shí)間3個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，按L9(34)正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)。
因素水平見(jiàn)表4。
表 4 因素水平表
Tab.4 Factors level table
2.2.2考察指標(biāo)的測(cè)定
2.2.2.1 芍藥苷的含量測(cè)定精密量取樣品液2 ml，置具塞錐形瓶中，加甲醇20 ml，按上述方法測(cè)定。
2.2.2.2 出膏率的測(cè)定精密量取樣品液20 ml，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，蒸干，照干燥失重法(《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄Ⅸ G)測(cè)定。
2.2.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析
見(jiàn)表5～8。
2.2.4小結(jié)
上述方差分析結(jié)果表明，以芍藥苷提取量為考察指標(biāo)，因素A無(wú)顯著性差異(P>0.10)，因素B無(wú)顯著性差異(P>0.10)，因素C有顯著性差異(P<0.05)，根據(jù)直觀分析結(jié)果，最佳水提取工藝為A3B3C3。
以出膏率為考察指標(biāo)，因素A無(wú)顯著性差異(P>0.10)，因素B無(wú)顯著性差異(P>0.10)，因素C有顯著性差異(P<0.05)，根據(jù)直觀分析結(jié)果，最佳水提取工藝為A3B3C3。
綜合上述兩方面結(jié)果，最佳水提取工藝為A3B3C3，即本品的最佳提取工藝為：取其白花蛇舌草等七味加水煎煮2次，第1次加12倍量水，煎煮1.5 h;第2次加10倍量水，煎煮1 h。
2.2.5 提取工藝驗(yàn)證
根據(jù)宮瘤消片提取工藝優(yōu)選結(jié)果，連續(xù)投料三批，三批結(jié)果平行，說(shuō)明提取工藝條件基本穩(wěn)定。
結(jié)果見(jiàn)表9。
表 9 驗(yàn)證工藝
Tab.9 validation technology
3 討論
本實(shí)驗(yàn)室對(duì)宮瘤消片中芍藥苷的水提取方法進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)中采用正交試驗(yàn)法，分別考察了加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)芍藥苷提取率和浸膏得率的影響。
浸膏是片劑中也是其他提取液中藥物發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，用它來(lái)比較提取工藝的優(yōu)劣，雖然直觀簡(jiǎn)便，但是雜質(zhì)的浸出也會(huì)影響浸膏得率，而且并不能標(biāo)志有效成分的量，故還選擇了芍藥苷作為考察指標(biāo)，因?yàn)榇怂幉闹械纳炙庈帐强咕挠行С煞�，�?duì)多種致病菌有較強(qiáng)的抑制和殺滅作用。
試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，藥材加熱時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，且要減壓干燥。
最后得出提取的優(yōu)選條件為A3B3C3，即藥材用水提取2次，第1次加12倍量水，煎煮1.5 h;第2次加10倍量水，煎煮1 h。
提取工藝是現(xiàn)代制備工藝的關(guān)鍵和重點(diǎn)，而采用正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝時(shí)，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的選定，即用什么指標(biāo)才能真正評(píng)價(jià)出工藝的優(yōu)劣又是難點(diǎn)。
在本實(shí)驗(yàn)中，采用浸膏得率、芍藥苷含量2個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，全面且具有代表性，較能客觀內(nèi)在地反映提取工藝的優(yōu)劣。
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活血通痹片水提醇沉工藝【3】
摘要 目的：篩選并優(yōu)化活血通痹片提取醇沉工藝。
方法：以干膏得率和提取物中芍藥苷含量為考察指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)化提取工藝。
單因素考察不同醇沉濃度對(duì)芍藥苷保留率的影響。
結(jié)果：通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化確定的提取條件為：藥材飲片第一次以10倍水，第二次8倍，提取2次，每次90min。
醇沉濃度為70%。
結(jié)論：該制備工藝合理，有效成分保留率高。
關(guān)鍵詞 芍藥苷
活血通痹片是廣東第二中醫(yī)院院內(nèi)制劑，由桃仁、紅花、赤芍等十三味藥組成，具有補(bǔ)腎、活血化瘀、除濕通絡(luò)等功效，主治腎虛血瘀所致腰膝疼痛，腰肌勞損，肢節(jié)屈伸不利等病癥。
赤芍為毛茛科植物芍藥Paceonia lacti flora Pall.的干燥根。
赤芍作為本方臣藥，具清熱涼血，散瘀止痛之功效。
因此，將赤芍中芍藥苷含量作為指標(biāo)性成分，結(jié)合提取工藝浸膏得率為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)其提取條件優(yōu)選，采用單因素考察法對(duì)醇沉工藝進(jìn)行優(yōu)化，為生產(chǎn)工藝參數(shù)的確定提供依據(jù)。
1 儀器與試藥
Agilent 1200高效液相色譜儀：G1316A檢測(cè)器、G1312A二元泵、G1329A柱溫箱、G2170A數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(Agilent，美國(guó));XS2055分析天平(梅特勒，瑞士)，藥材飲片(廣州致信藥業(yè)有限公司，批號(hào)20100206)，芍藥苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110736-200901)，水為超純水，甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。
2 方法與結(jié)果
2，1 干膏得率的測(cè)定方法 取各正交實(shí)驗(yàn)號(hào)濃縮液10ml于干燥蒸發(fā)皿中水浴蒸干，照干燥失重測(cè)定法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄IXG)測(cè)定，計(jì)算干膏得率。
2，2 芍藥苷含量測(cè)定
2，2，1 對(duì)照品制備：利用分析天平精密稱取已干燥的芍藥苷對(duì)照品5.12mg，置于50ml容量瓶，甲醇溶解定容至50ml，即芍藥苷為0.1024mg/ml。
2，2，2 樣品制備及測(cè)定：取各正交實(shí)驗(yàn)號(hào)濃縮液5ml，置干燥蒸發(fā)皿中80℃水浴蒸干，甲醇溶解定容至50ml。
同法制備陰性樣品。
2，2，3 色譜條件：色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6×150mm，5μm);流動(dòng)相：甲醇：0.1%磷酸水(14：86);檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，柱溫25℃。
將芍藥苷對(duì)照品分別進(jìn)樣，2、3、4、6、8、10μl，由圖1芍藥苷在該色譜條件下峰形良好，其中芍藥苷在204.8～1024ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：峰面積Y=1.57942389X-2.6122678，r=0.99995(見(jiàn)圖2)將陰性樣品和待測(cè)樣品進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果表明，陰性樣品色譜在芍藥苷相應(yīng)的保留時(shí)間上無(wú)色譜峰(見(jiàn)圖3)，樣品中芍藥苷色譜峰分離度良好(圖4)。
2，2 吸水率考察 按處方稱取的藥材，加10倍量的水浸泡，每隔1個(gè)小時(shí)觀察一次浸透心情況，直至藥材全部浸透，濾過(guò)，量取濾液體積，計(jì)算藥材吸水率，求得藥材吸水率為192.3%。
2，3 正交設(shè)計(jì)優(yōu)選提工藝 活血通痹片采用水煎煮提取工藝，在單因素試驗(yàn)考察的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，選取加水量(A)，提取次數(shù)(B)，提取時(shí)間(c)，作為考察因素，各取三水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，篩選最佳工藝條件，因素水平表見(jiàn)表1。
赤芍作為方中臣藥，芍藥苷為其主要成分，本試驗(yàn)以高效液相法測(cè)定提取液中芍藥苷的含量，作為評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，權(quán)重系數(shù)定為0.6;而作為有效成分煎出間接控制的一個(gè)指標(biāo)，藥效物質(zhì)提取的多少以干膏得率為考察指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)定為0.4，以兩指標(biāo)的結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)分。
試驗(yàn)時(shí)按處方量稱取藥材、飲片，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)各實(shí)驗(yàn)號(hào)進(jìn)行提取，濾過(guò)，濾液減壓濃縮，定容至200ml，備用。
分別按2.2項(xiàng)下方法測(cè)定干膏得率、芍藥苷含量，采用以下公式：
Y=(40/得膏率max)×得膏率+(60/(芍藥苷含量)max)×(芍藥苷)含量
進(jìn)行綜合評(píng)分，用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)評(píng)分結(jié)果作直觀分析和方差分析，以判斷各因素對(duì)提取效果的影響程度，篩選出在該試驗(yàn)條件下最優(yōu)的提取條件，試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。
由直觀分析可知，影響提取工藝效果的因素順序?yàn)椋禾崛r(shí)間(B)>提取次數(shù)(c)>加水量(A)，最佳工藝組合為A283C2。
方差分析結(jié)果顯示，提取次數(shù)和提取時(shí)間均對(duì)提取結(jié)果具有顯著性影響，而加水量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響無(wú)顯著性影響。
由于處方藥材吸水率為192.3%，綜合考慮縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本等綜合因素，選擇第一次加水10倍量，第二次加水8倍，提取2次，每次提取90min作為水提取工藝參數(shù)。
2，4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為確定該工藝條件的穩(wěn)定性，以篩選的最佳條件，驗(yàn)證3批，結(jié)果見(jiàn)表4。
驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)優(yōu)選結(jié)果吻合，表明正交試驗(yàn)優(yōu)選確定的工藝條件合理、穩(wěn)定、可行。
2，5 醇沉工藝優(yōu)選 中藥提取液一般體積較大，一般需進(jìn)一步分離和精制。
藥材的水提取藥液常用醇沉方法，以除去雜質(zhì)，從而達(dá)到減少服用量，提高藥物穩(wěn)定性的目的。
考慮本活血通痹復(fù)方制劑最后制備成片劑，載藥量小，所以對(duì)所得中藥提取液進(jìn)行醇沉精制，除去蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)等雜質(zhì)，進(jìn)一步增大載藥量。
由于不同醇沉濃度除雜效果和有效成分保留率不一，故采用單因素考察法，以芍藥苷保留率為指標(biāo)，考察不同醇沉濃度對(duì)醇沉效果的影響。
芍藥苷保留率計(jì)算方法如下：
芍藥苷保留率(%)=醇沉前芍藥苷含量/醇沉后上清液芍藥苷含量×100%
按處方比例稱取藥材4份，根據(jù)提取工藝試驗(yàn)結(jié)果，第一次加水10倍，第二次加水8倍，提取2次，各1.5h。
提取完成后濃縮定容至200ml(相對(duì)密度1.08～1.10)，分別按下表加入乙醇至相應(yīng)醇沉濃度，醇沉靜置過(guò)夜24h，取上清液，回收乙醇，濃縮定容至200ml，按2.2項(xiàng)下測(cè)定芍藥苷含量。
由表5可知，當(dāng)隨著醇沉乙醇濃度的加大，芍藥苷保留率不斷提高，醇沉濃度為70%時(shí)，芍藥苷保留率可達(dá)95%以上，因此，確定活血通痹片的醇沉工藝為濃縮至相對(duì)密度1.08～1.10后，加乙醇至70%醇沉，靜置過(guò)夜，取上清液，回收乙醇，濃縮，即得。
3 討論
中藥復(fù)方提取效果直接關(guān)系到產(chǎn)品的質(zhì)量和療效，選擇評(píng)價(jià)提取工藝優(yōu)劣的評(píng)價(jià)指標(biāo)是研究工作中的重要問(wèn)題，合理的提取工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)應(yīng)該是提取的有效成分質(zhì)和量的代表，也是提取物臨床作用性質(zhì)和強(qiáng)度的代表。
本文選取了方中臣藥芍藥中主要成分芍藥苷的含量以及得膏率二者綜合評(píng)分作為考察指標(biāo)，確定提取工藝為第一次加水10倍，第二次加水8倍，提取2次，各1.5h。
確定醇沉工藝為提取完成后，濃縮至含生藥1g/ml(相對(duì)密度1.08～1.10)，加乙醇至含醇量為70%，芍藥苷保留率可達(dá)95%以上。
活血通痹片是在依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論，結(jié)合目前藥理研究的基礎(chǔ)上化裁而來(lái)。
為了使其復(fù)合功效得到良好發(fā)揮，根據(jù)處方所含有效成分，在制定制備工藝路線時(shí)采取分步考察，以期達(dá)到對(duì)本方中脂溶性和水溶性有效成分最大限度的提取目的。
本實(shí)驗(yàn)對(duì)水提醇沉工藝進(jìn)行了初步探討，其他部分有待于進(jìn)一步完善報(bào)道。
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