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鼠同種異體腎上腺細(xì)胞腎被膜下移植
鼠同種異體腎上腺細(xì)胞腎被膜下移植
【摘要】 目的：觀察大鼠同種異體腎上腺細(xì)胞腎被膜下移植治療腎上腺皮質(zhì)功能不全的可行性，并提供一種有效的移植途徑。
方法：成年雄性Wistar大鼠40只，分為對(duì)照組(雙側(cè)腎上腺切除術(shù))，實(shí)驗(yàn)組(雙側(cè)腎上腺切除+腎被膜下細(xì)胞移植術(shù))，假手術(shù)組(僅暴露腎臟后關(guān)閉切口)，觀察大鼠體內(nèi)皮質(zhì)酮、醛固酮激素質(zhì)量濃度的動(dòng)態(tài)變化及局部新生組織的血管生長(zhǎng)和淋巴、巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。
結(jié)果：移植的腎上腺細(xì)胞可存活并能部分替代大鼠分泌皮質(zhì)酮、醛固酮的功能。
術(shù)后6周局部可見血管長(zhǎng)入，無明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
結(jié)論：植入腎被膜下的腎上腺細(xì)胞能存活并有分泌功能，且腎被膜下移植為腎上腺細(xì)胞提供良好的移植床。
【關(guān)鍵詞】 大鼠;腎上腺細(xì)胞;腎被膜下;異體移植
[Abstract]Objective： To observe the outcome of allotransplantation of adrenocortical cells in subrenal capsule in rats to treat insufficiency of adrenocortical function， and to apply an effective way of transplants.
Method： Cultured adrenocortical cells in vitro had transplanted into subrenal capsule with bilaterally adrenalectomized allorats， the plasma corticosterone and aldosterone level， graft survival and pathology were compared respectively.
Results： The transplanted adrenocortical cells could survive and partially represent functions of adrenal glomerulosa zona and fasciculate zona.
The plasma corticosterone and aldosterone levels were 80%、30% of sham_operated group eight weeks after operation respectively， the pale yellow tissue was visible in subrenal capsule and had been invaded by prominent blood vessels， the tissue had not been invaded by inflammatory cells.
Conclusion： Adrenocortical cells that have been transplanted into subrenal capsule can survive and secrete corticosterone and aldosterone， the subrenal capsule is a good position for transplantation of adrenocortical cell.
[Key Words]rat，adrenocortical cell，subrenal capsule，allotransplantation
腎上腺皮質(zhì)功能減退者可用激素替代治療，但需終身服藥，劑量難以掌控，且單純用糖皮質(zhì)激素不能彌補(bǔ)腎上腺所有激素的短缺，特別是沒有應(yīng)急能力，因此，目前認(rèn)為腎上腺移植仍然是治療慢性腎上腺皮質(zhì)功能減退最理想的方法[1]。
但由于器官來源困難及移植后的免疫排斥，其臨床效果，特別是遠(yuǎn)期療效不甚滿意。
而腎上腺細(xì)胞移植有細(xì)胞來源豐富、可長(zhǎng)期保存和細(xì)胞的弱免疫原性的特點(diǎn)，可成為治療腎上腺皮質(zhì)功能不全的理想方法。
本實(shí)驗(yàn)將體外培養(yǎng)的腎上腺細(xì)胞進(jìn)行腎被膜下移植，為臨床應(yīng)用腎上腺細(xì)胞移植提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和耗材
成年雄性Wistar大鼠(武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)40只，體質(zhì)量200～250g，2周齡Wistar大鼠(提供處同上)60只。
膠原酶Ⅰ型、DNA酶、胰蛋白酶、DMEM/F_12培養(yǎng)基、3_(4，5_二甲基_2_噻唑)_2，5_二苯基溴化四唑(四甲基偶氮唑藍(lán)，MTT)、胎牛血清(Sigma公司，美國(guó))，皮質(zhì)酮酶免法試劑盒(DSL公司，美國(guó))，醛固酮放免試劑盒(中國(guó)原子能研究院同位素研究所，中國(guó))。
1.2 腎上腺細(xì)胞體外培養(yǎng)與移植方法
無菌切取2周齡大鼠的雙側(cè)腎上腺，D_Hank?s液洗滌數(shù)次后去除附于腺體表面的血跡，在無菌罩內(nèi)小心剔除腎上腺周圍脂肪，剪成1mm×1mm×1mm碎塊，置于質(zhì)量濃度1g/L�、裥湍z原酶、質(zhì)量濃度5mg/L DNA酶的消化液中37℃水浴振蕩消化20min，待溶液呈粘糊狀時(shí)加入適量含小牛血清的培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)，400目鋼絲網(wǎng)過濾，收集濾液200g離心10min，棄上清液，Hank?s液、DMEM/F_12培養(yǎng)基依次各洗滌2次，200g離心10min收集細(xì)胞。
于DMEM/F_12培養(yǎng)基中重懸，反復(fù)吹打使細(xì)胞均勻分散呈單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度，錐蟲藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞存活率>95%，然后接種至無菌培養(yǎng)瓶37℃、體積分?jǐn)?shù)95%的O2、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)，原代培養(yǎng)1周后進(jìn)行細(xì)胞移植。
5_乙基_5_(1_甲基丁基)_2，4，6(1H，3H，5H)_噻啶三酮_鈉鹽(戊巴比妥鈉溶液，質(zhì)量濃度30mg/kg)腹腔麻醉，對(duì)照組(10只)行雙側(cè)腎上腺切除術(shù)，實(shí)驗(yàn)組(20只)行雙側(cè)腎上腺切除術(shù)+腎被膜下細(xì)胞移植：沿左腎上腺切除術(shù)的切口將腎臟外置，于左腎下極鈍性分離腎被膜建立被膜下腔隙，將細(xì)胞懸液注入腔隙內(nèi)，然后用鈦夾關(guān)閉腎被膜，每只大鼠移植2×106個(gè)腎上腺細(xì)胞;假手術(shù)組(10只)僅暴露腎臟后關(guān)閉切口。
術(shù)后1周肌注激素替代治療以減少術(shù)后死亡率，術(shù)后飲NS。
術(shù)后第2、4、6、8周8：00～9：00 AM內(nèi)齜采血測(cè)血漿皮質(zhì)酮、醛固酮質(zhì)量濃度，采血后取移植體行光鏡檢查。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
以±s表示，組間差異用t檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 腎上腺細(xì)胞分泌功能
對(duì)照組平均存活8.2d，術(shù)后2周血漿皮質(zhì)酮、醛固酮質(zhì)量濃度顯著下降，術(shù)后8周實(shí)驗(yàn)組血漿皮質(zhì)酮質(zhì)量濃度約為假手術(shù)組的80%，血漿醛固酮水平恢復(fù)較慢，術(shù)后4周血漿醛固酮質(zhì)量濃度僅為假手術(shù)組的10%，術(shù)后8周實(shí)驗(yàn)組血漿醛固酮質(zhì)量濃度與假手術(shù)組比仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1、2)。
表1 血漿皮質(zhì)酮質(zhì)量濃度與對(duì)照組和假手術(shù)組比 1)P<0.05;與假手術(shù)組比 2)P<0.05 D表示動(dòng)物已死亡或檢測(cè)低于試劑盒的檢測(cè)范圍表2 血漿醛固酮質(zhì)量濃度(與對(duì)照組和假手術(shù)組比 1)P<0.05;與假手術(shù)組比 2)P<0.05 D表示動(dòng)物已死亡或檢測(cè)低于試劑盒的檢測(cè)范圍
2.2 腎上腺細(xì)胞移植病理結(jié)果
2、4周腎被膜下鏡下可見散在細(xì)胞團(tuán)塊附著在腎實(shí)質(zhì)表面，有少許形成組織團(tuán)塊，腎上腺細(xì)胞呈圓形或多角形，胞體大，細(xì)胞質(zhì)透明，內(nèi)有許多大小規(guī)則的顆粒(圖1，封2);6周腎被膜下肉眼可見黃、白色組織，與腎實(shí)質(zhì)緊密相連，鏡下可見血管明顯從腎實(shí)質(zhì)長(zhǎng)入，且周圍有連接組織與腎實(shí)質(zhì)和腎被膜連接，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);8周見組織已被明顯血管化，細(xì)胞呈條索狀生長(zhǎng)，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2，封2)。
3 討論
腎上腺是一個(gè)實(shí)質(zhì)內(nèi)分泌器官，其主要功能是分泌糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素，進(jìn)行細(xì)胞移植時(shí)不需要過多考慮其解剖結(jié)構(gòu)的重建，僅僅需要它能分泌肌體所必需的激素即可。
而且與傳統(tǒng)器官移植相比，細(xì)胞移植可以利用細(xì)胞體外擴(kuò)增技術(shù)，以少量細(xì)胞擴(kuò)增到細(xì)胞移植所需要的量，解決器官移植供體來源不足的難題，在低溫條件下，待移植的細(xì)胞可以在體外長(zhǎng)期保存，而待移植的器官保存時(shí)間則相對(duì)較短，并且體外培養(yǎng)可以改變細(xì)胞的免疫原性和抗原性，減少免疫排斥反應(yīng)發(fā)生的可能或減輕免疫排斥反應(yīng)發(fā)生的程度[2]。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后血漿皮質(zhì)酮、醛固酮質(zhì)量濃度逐漸上升，血漿皮質(zhì)酮質(zhì)量濃度術(shù)后2周與對(duì)照組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且血漿皮質(zhì)酮質(zhì)量濃度在術(shù)后8周能達(dá)到假手術(shù)組的80%(P<0.05)，說明移植細(xì)胞進(jìn)入大鼠體內(nèi)，移植細(xì)胞能存活，且隨移植時(shí)間的延長(zhǎng)移植細(xì)胞的功能狀態(tài)逐漸恢復(fù)。
但血漿醛固酮的恢復(fù)較慢，術(shù)后8周也只有假手術(shù)組的30%，這與大多數(shù)報(bào)道一致。
可能與移植后球狀帶細(xì)胞逐漸喪失醛固酮分泌功能而具有皮質(zhì)酮分泌功能有關(guān)[3]。
移植細(xì)胞的存活在很大程度上取決于移植部位。
腎被膜下腎上腺細(xì)胞移植滿足以下幾個(gè)條件：血供豐富，細(xì)胞移植成功與否關(guān)鍵在于移植后的第1周，血供能否建立是成敗的核心[4];便于移植操作;接近腎上腺正常的解剖部位。
細(xì)胞移植不同于器官移植，異位移植會(huì)因?yàn)榧?xì)胞所處的內(nèi)環(huán)境改變而致移植細(xì)胞不能長(zhǎng)期存活。
缺點(diǎn)是移植操作較復(fù)雜，如果能結(jié)合腹膜后腹腔鏡技術(shù)，移植操作過程將大大簡(jiǎn)化。
本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鼠腎被膜下腎上腺細(xì)胞移植能夠提供其機(jī)體所必需的糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素，與參考文獻(xiàn)[5]結(jié)果一致。
實(shí)驗(yàn)組血漿皮質(zhì)酮質(zhì)量濃度在術(shù)后6周明顯超過術(shù)后8周的(P<0.05)，與病理結(jié)果對(duì)照可發(fā)現(xiàn)術(shù)后6周血管從腎實(shí)質(zhì)長(zhǎng)入移植體，可能與其分泌的糖皮質(zhì)激素通過新生血管大量入血有關(guān)。
腎上腺皮質(zhì)分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，促腎上腺皮質(zhì)激素不僅調(diào)節(jié)皮質(zhì)激素的合成，還在體內(nèi)促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞分泌VEGF，可見充分的血供對(duì)腎上腺保持功能非常重要。
實(shí)驗(yàn)表明，VEGF、成纖維生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子_β、血小板衍生生長(zhǎng)因子、血管生成素_1均參與了血管形成[6]。
移植細(xì)胞的免疫原性是影響移植效果的重要因素之一，一般認(rèn)為移植前將細(xì)胞在適當(dāng)條件下培養(yǎng)，可降低移植物的免疫原性，減輕排斥反應(yīng)，同時(shí)腎上腺細(xì)胞分泌的糖皮質(zhì)激素本身可抑制免疫排斥反應(yīng)，因?yàn)榇笫竽I被膜下是一個(gè)免疫特許部位。
本實(shí)驗(yàn)組在2、4周細(xì)胞團(tuán)塊及6周、8周帶有血管的組織均沒有見到明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
證明腎被膜下也是同種異體腎被膜下腎上腺細(xì)胞移植的免疫裸區(qū)。
雖然腎上腺細(xì)胞移植在短短的10余年時(shí)間取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但移植細(xì)胞的長(zhǎng)期存活、功能恢復(fù)和免疫排斥難題一直困擾著人們。
為解決這些問題，本實(shí)驗(yàn)通過大鼠腎上腺細(xì)胞腎被膜下移植進(jìn)行有益嘗試，并找到更好的移植途徑，但移植細(xì)胞功能替代及遠(yuǎn)期效果還有待進(jìn)一步研究。
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