- 相關(guān)推薦
維A酸對(duì)大鼠胃癌前病變?cè)鲋臣?xì)胞核抗原和端粒酶活性的影響論文
【摘要】 目的 觀察維A酸（RA）對(duì)大鼠胃癌前病變?cè)鲋臣?xì)胞核抗原（PCNA，用增殖指數(shù) PI表示） 和端粒酶活性（用hTERT表示）的影響。方法 采用甲硝基亞硝基胍（MNNG）、0.03%雷尼替丁、56 ℃15%鹽水、0.85%脫氧膽酸鈉、40%乙醇、饑飽失常等多種因素制作大鼠胃癌前病變模型，免疫組化方法檢測(cè)正常組、自然恢復(fù)組、RA 20 mg/kg和RA 40 mg/kg組大鼠胃黏膜組織中 PI 和 hTERT 蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 正常組和RA 40 mg/kg組PI、hTERT 蛋白陽性率均較自然恢復(fù)組低，差異有顯著性（P<0.01或P<0.05）。結(jié)論 維A酸可能是通過抑制端粒酶及細(xì)胞增殖活性，發(fā)揮逆轉(zhuǎn)胃癌前病變的作用。Abstract:Objective To observe the effect of retinoic acid（RA） on proliferating cell nuclear antigen (PCNA, represented with proliferating index, PI) and telomerase activity (represented with human telomerase reverse transcriptase，hTERT) in rats with gastric precancerous lesion． Methods The model was established by MNNG together with other factors including 15% 56 ℃ brine，sodium deoxycholate， 40% alcohol stimulus， 0.03% ranitidine， undue hunger，and overeating． PCNA(converted to PI) and hTERT was detected by immunohistochemical method， in normal group， spontaneous recovery group，and RA（20 mg/kg and 40 mg/kg） group．Results PI and hTERT of normal group and RA 40mg/kg groups were lower detected than spontaneous recovery group and was significantly different (P<0.01 or P<0.05)． Conclusion RA makes GPL reversed in rates by inhibiting activity of telomerase and cell proliferating．
Key words: retinoic acid； precancerous lesions； proliferating cell nuclear antigen；telomerase
利用某些化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化為正常細(xì)胞或近似正常細(xì)胞，已成為抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)，維A酸是腫瘤分化誘導(dǎo)劑的代表之一。維A酸對(duì)多種化學(xué)致癌過程和誘癌作用有抑制作用，具有逆轉(zhuǎn)胃癌前病變大鼠的腸化生和不典型增生作用，對(duì)急性早幼白血病M 型的療效，已被證實(shí)和公認(rèn)［1，2］。為進(jìn)一步探討其作用機(jī)理，本文觀察維A酸對(duì)大鼠胃癌前病變?cè)鲋臣?xì)胞核抗原和端粒酶活性的影響，報(bào)告如下。
1 材料
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)，雄性 Wistar大鼠，6周齡， 體質(zhì)量100～120 g,由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供 ,生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2003-0005。
1.2 主要藥品及試劑維A酸( RA) ，上海第六制藥廠；甲硝基亞硝基胍（MNNG）為 Fluka 公司產(chǎn)品；脫氧膽酸鈉 ，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；雷尼替丁， 杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司；無水乙醇 ，上海振新興化工一廠；氯化鈉 ，天津化學(xué)試劑三廠；即用型PCNA 單抗、即用型端粒酶催化活性亞單位（hTERT）多抗試劑盒、SPDAB 即用型顯色試劑盒均購自北京中山生物技術(shù)公司。
1.3 主要儀器CUT 5062輪轉(zhuǎn)切片機(jī)，德國SLEE公司；BX 40系統(tǒng)顯微鏡，日本OLYMPUS公司；HPIAS1000 型顯微攝像全自動(dòng)圖像分析儀，同濟(jì)千屏影像工程公司。
2 方法
2.1 造模及給藥方法按綜合法復(fù)制模型 ［ 3］。大鼠50只，隨機(jī)抽取 11只作為正常對(duì)照組，其余 39只用于造模。正常對(duì)照組大鼠不做任何處理；造模大鼠每日自由飲用 100 μg/mL MNNG 液（新鮮配制，飲水瓶用油漆涂黑避光），上午用 56 ℃、 ρ=15%的氯化鈉液 10 mL/kg 灌胃。攝食為含ρ= 0.03%雷尼替丁的純鼠飼料，饑飽相間，進(jìn)食2 d的當(dāng)天下午，用 ρ=0.85%脫氧膽酸鈉溶液按10 mL/kg 灌胃；禁食1 d的當(dāng)天下午，用 φ=40％乙醇10 mL/kg 灌胃，持續(xù)6個(gè)月(造模過程中死亡6只大鼠)。6個(gè)月末時(shí)，取正常和造模大鼠各1只殺檢，觀察組織病理學(xué)變化，確認(rèn)模型是否成功。模型成功后，將造模存活的大鼠，隨機(jī)分為：自然恢復(fù)組12只、RA 20 mg/kg和RA 40 mg/kg組各10只。
正常對(duì)照組和自然恢復(fù)組大鼠給蒸餾水10 mL/kg； RA 20 mg/kg和RA 40 mg/kg組大鼠分別給0.2% RA和 0.4% RA 10 mL/kg灌胃，每日1次，連續(xù)3個(gè)月(自然恢復(fù)組大鼠死亡 4只)。末次給藥后，所有動(dòng)物禁食1 d，放血處死，剖腹取胃，沿胃大彎剪開，生理鹽水沖洗，肉眼觀察，平鋪于硬紙板上，于胃竇部剪取組織1塊，Φ=4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片 5 μｍ，免疫組織化學(xué)染色。
2.2 檢測(cè)方法免疫組織化學(xué)用 SP法，按試劑說明書操作，DAB 顯色，PBS 代替一抗作陰性對(duì)照，已知陽性切片作陽性對(duì)照。免疫組化染色陽性信號(hào)為棕色，PCNA 陽性物質(zhì)定位于細(xì)胞核， hTERT 陽性物質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)。采用顯微攝像計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，每張切片檢測(cè)5個(gè)視野（×400）。計(jì)算PCNA陽性細(xì)胞數(shù)以及腺上皮細(xì)胞總數(shù)（每例≥200 個(gè)），求出細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）， PI=PCNA 陽性細(xì)胞數(shù)/腺上皮細(xì)胞總數(shù)×100%。hTERT：無陽性細(xì)胞或陽性細(xì)胞數(shù)<25%為（-），陽性細(xì)胞數(shù)25％～50%為（＋），陽性細(xì)胞數(shù) 50％～75%為（＋＋），陽性細(xì)胞數(shù)>75%為（＋＋＋）。
2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理PI 值的比較，采用t檢驗(yàn)； hTERT 蛋白表達(dá)陽性率的比較，采用χ2檢驗(yàn)（校正χ2值計(jì)算），以P<0.05為差異有顯著性。
3 結(jié)果
3.1 維A酸對(duì)胃黏膜細(xì)胞增殖指數(shù)的影響 正常大鼠胃黏膜增生帶細(xì)胞可見 PCNA 陽性細(xì)胞； 自然恢復(fù)組大鼠胃黏膜細(xì)胞增殖指數(shù)明顯高于正常對(duì)照組和維A酸各組， 差異有非常顯著性（P<0.01）；維A酸組高于正常對(duì)照組，提示維A酸有一定的抑制胃黏膜細(xì)胞增殖活性作用，見表 1。
表1 維A酸對(duì)胃黏膜細(xì)胞增殖指數(shù)的影響（略）
Tab.1 Effect of RA on PI of the gastric mucosa
與自然恢復(fù)組比較： *P<0.01；與正常對(duì)照組比較： ▲P<0.01 ( t檢驗(yàn) )
3.2 維A酸對(duì)胃黏膜細(xì)胞hTERT 蛋白表達(dá)陽性率的影響 正常大鼠胃黏膜沒有hTERT 蛋白表達(dá)。自然恢復(fù)組大鼠8例均呈陽性表達(dá)，陽性率達(dá)100％。維A酸20 mg/kg和40 mg/kg組 hTERT 蛋白陽性率分別為60%和40% ,較自然恢復(fù)組低，見表 2。
表2 維A酸對(duì)胃黏膜細(xì)胞hTERT 蛋白表達(dá)陽性率的影響（略）
Tab.2 Effect of RA on hTERT positive rate of the gastric mucosa
與自然恢復(fù)組比較：*P<0.05;**P<0.01；與正常組比較：▲P<0.05(χ2檢驗(yàn))
4 討論
增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）是目前被公認(rèn)的能較好地判斷細(xì)胞增殖狀態(tài)的一項(xiàng)指標(biāo)［ 4］。
PCNA又稱周期數(shù)，是存在于細(xì)胞核內(nèi)的一種周期蛋白。研究表明，在胃癌前病變階段已存在PCNA的表達(dá)異常，推論胃黏膜發(fā)生癌變的機(jī)制之一，可能是某些致癌因素引起持續(xù)的胃黏膜細(xì)胞增殖過度。
端粒酶活化是細(xì)胞保持持續(xù)分裂增殖的基礎(chǔ)，與細(xì)胞的異常增殖密切相關(guān)，是腫瘤發(fā)生學(xué)上的一個(gè)共同途徑，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起非常重要的作用［5］。端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，至少由3個(gè)亞單位組成，即端粒酶RNA、端粒酶相關(guān)蛋白Ⅰ和端粒酶催化活性亞單位（hTERT），但僅 hTERT 水平與細(xì)胞端粒酶活性呈正相關(guān)［6］。
研究發(fā)現(xiàn)由胃黏膜正常細(xì)胞→胃癌前病變→胃癌的過程中，端粒酶逐漸被激活［7］，
而且其陽性率、活性水平相應(yīng)地逐漸增高；也有研究發(fā)現(xiàn)端粒酶陽性的胃癌或癌前病變細(xì)胞增殖活性（PCNA）明顯高于陰性者［8］，
均說明端粒酶的激活在胃黏膜癌變形成、發(fā)展中扮演重要角色。
本實(shí)驗(yàn)?zāi)M臨床發(fā)病原因，采用多因素建立胃癌前病變大鼠模型，側(cè)重維A酸對(duì)其逆轉(zhuǎn)作用機(jī)理研究。結(jié)果顯示：正常大鼠胃黏膜增殖帶可見PCNA 陽性細(xì)胞，但沒有hTERT 活性表達(dá)，自然恢復(fù)組大鼠 PI明顯高于正常組，hTERT蛋白陽性表達(dá)率 100%，表明在胃癌前病變階段，由于各種因子的刺激而導(dǎo)致了端粒酶被激活和細(xì)胞增殖活性增加，使部分細(xì)胞逃脫死亡危象，并出現(xiàn)永生化或惡性增殖。
模型動(dòng)物應(yīng)用維A酸治療 3個(gè)月后，大鼠胃黏膜 PI和hTERT 蛋白的表達(dá)顯著降低，表明維A酸對(duì)其端粒酶活性和細(xì)胞增殖活性有一定的抑制作用。由此推論維A酸逆轉(zhuǎn)大鼠胃癌前病變的機(jī)制之一，可能與其抑制了大鼠胃癌前病變PCNA和端粒酶活性，從而抑制胃黏膜惡性增殖，增加細(xì)胞穩(wěn)定性，恢復(fù)細(xì)胞增殖和凋亡平衡有關(guān)。
【維A酸對(duì)大鼠胃癌前病變?cè)鲋臣?xì)胞核抗原和端粒酶活性的影響論文】相關(guān)文章：
分析護(hù)理干預(yù)對(duì)胃癌患者的負(fù)面情緒的影響論文10-08
暖宮舒經(jīng)顆粒對(duì)大鼠子宮微循環(huán)的影響10-07
瓜萎的化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展論文10-08
肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究論文10-09
探討胃癌腸梗阻病患的護(hù)理論文10-09