醫(yī)學(xué)碩士論文開題報告

　　題目：血清TLR4及腸型脂肪酸結(jié)合蛋白在NEC早期診斷中的臨床意義

　　一、立論依據(jù)

　　(包括研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析，并附主要參考文獻及出處)

　　對基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合國際科學(xué)發(fā)展趨勢，論述本課題的科學(xué)意義;

　　對應(yīng)用基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合學(xué)科前沿、圍繞國民經(jīng)濟和社會發(fā)展中的重要科技問題，論述其應(yīng)用情景。

　　(一) 研究意義：

　　新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)是新生兒時期嚴(yán)重威脅生命的消化系統(tǒng)急癥，以早產(chǎn)兒、小于胎齡兒發(fā)病者較多，在NICU患兒中的發(fā)病率高達10%，是早產(chǎn)兒死亡的重要原因之一。臨床以腹脹、腹瀉、黏液血便和膽汁樣嘔吐為主要表現(xiàn)，腹部X線平片以腸壁囊樣積氣為特征，腸道病變范圍可局限或廣泛，回腸累及最多，黏膜呈凝固性壞死，粘膜下層彌漫性出血或壞死，嚴(yán)重者腸壁全層壞死甚至穿孔。

　　目前有很多方法用于診斷NEC。除了可以根據(jù)臨床表現(xiàn)診斷外，腹部X線片是最常用的輔助檢查方法，雖然其用于診斷NEC的特異度較高，但對于早期診斷NEC幫助不大，目前也有很多關(guān)于IL-8、IL-10、IL-1受體拮抗劑等生化指標(biāo)用于診斷NEC的研究，但缺乏較好的用于早期診斷NEC的血生化指標(biāo)。

　　TLR是由Nomuria等在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)與果蠅Toll蛋白相似的一種蛋白。TLR在不同細胞的表達和識別不同細胞因子在多種疾病的發(fā)病機制中起重要作用，目前研究發(fā)現(xiàn)TLR參與腫瘤、腸道免疫性疾病等多種疾病的發(fā)病。在人類體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的TLR家族共有10個成員，其中TLR4是近年來研究較多的其中一個，TLR4主要表達在內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞及DC上。

　　I-FABP是由小腸單層柱狀上皮細胞分泌的一種小分子蛋白質(zhì)，占成熟的細胞基質(zhì)蛋白的2%。腸缺血早期僅有黏膜受累時即可因為細胞通透性升高而導(dǎo)致IFABP釋放入血，具有較好的器官特異性。

　　本研究旨在通過檢測NEC患兒血清中的TLR4及腸型脂肪酸結(jié)合蛋白，監(jiān)測其在NEC中的動態(tài)變化，作為NEC嚴(yán)重程度的生化指標(biāo)，可為輔助診斷NEC提供依據(jù)，達到早期干預(yù)的目的。

　　(二)國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析：

　　1、TLR4上調(diào)導(dǎo)致NEC發(fā)生的機制研究

　　1)、與LPS結(jié)合后，被激活的TLR4可以通過髓樣分化因子88(MyD88)依賴性和非依賴性兩個途徑介導(dǎo)炎癥因子的釋放。其中MyD88依賴性途徑主要介導(dǎo)NF-kB活化和細胞因子產(chǎn)生，而MyD88的非依賴性途徑主要誘導(dǎo)LPS的干擾素(IFN)，以及干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IP10)基因、糖皮質(zhì)激素衰減反應(yīng)基因16(GARG-16)、干擾素調(diào)節(jié)基因1(IRG-1)的表達和DC的成熟，激活下游NF-kB、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38信號通路，誘導(dǎo)促炎癥因子如白細胞介素-1(IL-1)6、12和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等的表達。

　　2)、Chan等研究發(fā)現(xiàn)，TLR4激活后能影響腸道粘膜的修復(fù)能力，此與其減少腸道細胞增殖、降低內(nèi)皮細胞基底部粘附力及減少內(nèi)皮細胞移動到受損位置的數(shù)量有關(guān)。Sodhi等研究證明，TLR4通過抑制細胞的增殖分化作用于wnt-β-5信號系統(tǒng)，使腸道粘膜修復(fù)能力受損，加重NEC的病理變化。

　　3)、最新研究表明，TLR4不僅可以與LPS結(jié)合誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、損傷腸道粘膜導(dǎo)致NEC發(fā)生，許多分子蛋白如纖維結(jié)合蛋白、透明質(zhì)酸。硫酸肝素等均能激活TLR4，在無外來病原菌時TLR4表達可能增高，釋放大量炎癥因子從而發(fā)生NEC的炎癥瀑布鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。這一發(fā)現(xiàn)，可以解釋一些無明顯感染因素引起的NEC。

　　2、細菌及其產(chǎn)物如何引起腸上皮細胞的損傷探討

　　血小板活化因子(PAF)在NEC的發(fā)生中起重要作用。有研究應(yīng)用缺氧、低溫、人工喂養(yǎng)、細菌感染等方法制成了NEC的動物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腸上皮的PAF及其受體的表達增高，阻斷PAF的受體表達后NEC的發(fā)生率明顯下降。PAF表達增高可使腸壁血管通透性增高、白細胞游出、細胞粘附分子的合成增多及活性氧生成增加，從而損傷腸壁。有研究表明，PAF可活化腸上皮細胞的STAT，使磷酯酶A2及內(nèi)皮素一1的合成增加，并可通過上bax的表達而誘導(dǎo)腸上皮細胞凋亡，從而損傷腸上皮細胞、破壞細胞問的連接而引起細菌移位。另外，PAF還可誘導(dǎo)腸上皮細胞產(chǎn)生TLR4，后者可活化IKK，從而激活NFxB而引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)。如果敲除TLR4，則NEC的發(fā)生率明顯降低，說明TLR4在NEC的發(fā)生中也有重要作用。

　　3、沈滌華等研究表明I—FABP可以作為早期腸缺血較理想的生物學(xué)指標(biāo)，國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)NEC患兒血清I-FABP水平明顯升高，且與NCE嚴(yán)重程度有關(guān)。

　　4、 Thuijls等研究發(fā)現(xiàn)重癥NEC患兒在早期血I-FABP水平即明顯升高。當(dāng)臨床出

　　現(xiàn)輕度腹脹，大便隱血陽性懷疑NEC時，血、尿I—FABP水平在發(fā)展成為重癥NEC的患兒

　　會明顯高于診斷為其他疾病和病情穩(wěn)定在NECI期或Ⅱ期的患兒。

　　主要參考文獻

　　1、 Hans Van Goudoever，陳超，張蓉.新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎的熱點問題.中國循證兒科雜志 2011，06(5).

　　2、 鄒靜靜，陳運彬.TOLL樣受體在新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎中的表達及作用.中國新生兒科雜志 2012,27(5).

　　3、 李志杰，劉靖華，姜勇.ToLL樣受體的發(fā)現(xiàn)及其研究進展.中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2003,15:694-697.

　　4、 Viriyakosol S,Tobias PS,Kitchens RL,et al..MD-2 binds to bacterial lipopolysaccharide.J Biol Chem，2001,276:38044-38051.

　　5、 Johnson GB, Bruun GJ,Kodaira Y,et al.Receptor-mediated monitoring of tissue well-being via detection of soluble heparin

　　sulfate by Toll-like receptor4.J Immunol，2002,168:5233-5239.

　　6、 Gribar SC,Sodhi CP,Richardson WM,et al.Reciprocal expression and signalingof TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis.J Immunol，2009,182:636-646.

　　7、 馮杰雄.美國新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎研究現(xiàn)狀.中華小兒外科雜志.2006，27(7).

　　8、 沈滌華，施誠仁，吳燕，等.腸脂肪酸結(jié)合蛋白(I-FABP)在腸缺血早期診斷的意義[J].中華小兒外科雜志，2004，25(2)：176—179.

　　二、研究方案

　　1.研究目標(biāo)、研究內(nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題

　　NEC分三期：

　　一期為可疑病例，有非特異性癥狀，此時患兒體溫不穩(wěn)定，嗜睡、呼吸暫停，胃腸道癥狀包括吃奶差、胃潴留、嘔吐、輕微腹脹，腹部X線平片可以正�；蚰c擴張。

　　二期為確診病例;

　　三期為重癥病例，死亡率高。

　　研究目標(biāo)：

　　通過檢測血清TLR4及腸型脂肪酸結(jié)合蛋白(I-FABP)水平，探尋兩者在早期診斷新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)中的價值。

　　研究內(nèi)容：

　　實驗分組

　　實驗組：共二組

　　早期NEC組：NEC一期患兒

　　晚期NEC組：NEC二期患兒、NEC三期患兒。

　　對照組：正常新生兒

　　所選病例均為早產(chǎn)兒

　　各組研究對象均空腹采血(時機：納入實驗組后24小時內(nèi))。

　　對照組于出生后1—5 d內(nèi)抽血檢查。

　　標(biāo)本：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

　　用ELISA方法測定血清中TLR4及腸型脂肪酸結(jié)合蛋白水平。

　　試劑盒：上海裕平生物科技有限公司生產(chǎn)的人Toll樣受體4(TLR4)ELISA試劑盒和I-FABP試劑盒。

　　對比檢測結(jié)果，觀察實驗組中各期患兒TLR4及腸型脂肪酸結(jié)合蛋白水平，與對照組進行比較。

　　擬解決的關(guān)鍵問題：

　　通過本研究觀察早期NEC組和晚期NEC組TLR4及腸型脂肪酸結(jié)合蛋白水平，各期間TLR4及腸型脂肪酸結(jié)合蛋白水平是否存在差異。

　　2.擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實驗方案及可行性分析

　　研究方法：

　　采用病例對照研究方法分析TLR4和腸型脂肪酸結(jié)合蛋白在NEC患兒血清中的濃度變化，探討二者與NEC的關(guān)系。

　　統(tǒng)計學(xué)分析：

　　采用SPSSl6.0統(tǒng)計軟件。

　　正態(tài)分布的計量資料采用數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 組間比較采用單項方差分析，兩兩比較應(yīng)用LSD法;

　　非正態(tài)分布計量資料采用中位數(shù)(四分位間距)(M(Q))表示，組間比較采用秩和檢驗;

　　計數(shù)資料采用構(gòu)成比表示，統(tǒng)計學(xué)分析采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗

　　血清TLR4及腸型脂肪酸結(jié)合蛋白(I-FABP)水平與NEC嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析采用spearman相關(guān)分析

　　p<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義

　　技術(shù)路線：

　　選取合適的實驗組和對照組→采集血標(biāo)本→進行試驗→整理數(shù)據(jù)→數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

　　→撰寫論文

　　3. 本課題的創(chuàng)新之處

　　通過研究，探索性發(fā)現(xiàn)能早期診斷NEC的較敏感的生化指標(biāo)，為診斷提供依據(jù) 。

　　4、研究計劃及預(yù)測進展

　　2012年6月-2013年2月，閱讀文獻，論證課題可行性，并報經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過

　　2013年2月-2014年2月，標(biāo)本采集;

　　2014年3月，試驗階段;

　　2014年3月-2014年5月，完成科研論文。

　　4. 預(yù)期研究成果

　　NEC患兒血清中的TLR4及腸型脂肪酸結(jié)合蛋白水平與嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

　　三、研究基礎(chǔ)

　　1.與本課題有關(guān)的，前期研究工作積累和已取得的研究工作成績

　　1)本人從事新生兒科工作，對NEC較為常見，病例易得到。

　　2)前期已采集大量的血標(biāo)本。

　　3)已閱讀大量的相關(guān)文獻，為研究工作打好基礎(chǔ)。

　　2.已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑(包括利用國家重點實驗室和部門開放實驗室的計劃與落實情況)

　　1)血標(biāo)本易采集，

　　2)試驗條件已達到，

　　3)試劑盒易購買，

　　4)試驗條件已達到。

　　3.近期已發(fā)表與本課題有關(guān)的主要論著目錄

　　1、陸妹 朱小瑜 劉登禮 陸亞東 •新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎危險因素臨床分析•中國新生兒科雜志•2012•27(6) •382

　　2、李粹 任雪云 蔡文仙 牛峰海•細胞因子及腸脂肪酸結(jié)合蛋白在新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎早期診斷中的價值探討•山東醫(yī)藥•2013•53(14)•50

　　3、秦嘉麗 韋紅 李祿全 王佚•血清腸型脂肪酸結(jié)合蛋白在診斷新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎中的意義•中華小兒外科雜志•2013•34(8)•590

　　4、許笑南 何少茹 鄭曼利 •新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎各期危險因素差異分析•中華實用兒科臨床雜志•2013•28(19) •1483

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