青紫薯色素安全性評(píng)價(jià)

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　　【摘要】目的 對(duì)青紫薯色素安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法 采用最大給藥量試驗(yàn)，小鼠每天3次、每次36 mL/kg灌胃給予200 g/L的青紫薯色素水溶液14 d，觀察其體質(zhì)量變化和死亡情況;以倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞(CHL)行染色體畸變?cè)囼?yàn)，對(duì)青紫薯色素進(jìn)行毒理學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果 小鼠灌胃給予21.6 g/(kg·d) 青紫薯色素后未出現(xiàn)毒性反應(yīng)，也無(wú)動(dòng)物死亡，體質(zhì)量增長(zhǎng)良好;CHL染色體畸變?cè)囼?yàn)呈陰性，染色體畸變率在正常范圍內(nèi)。結(jié)論 青紫薯色素灌胃給藥21.6 g/(kg·d)未出現(xiàn)急性毒性反應(yīng)，青紫薯色素在1.00 g/L劑量下無(wú)致突變作用。

　　【關(guān)鍵詞】 色素類(lèi) 甘薯 急性毒性試驗(yàn) 染色體畸變

　　甘薯是一種耐寒、耐貧瘠、適應(yīng)性廣、污染少、易栽培的糧食作物[1]。國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果顯示，甘薯具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤、增強(qiáng)記憶等多種生理功能[2～4]。青紫心甘薯是紫甘薯的改良品種，青紫薯色素由青紫心甘薯采用酸性溶劑萃取法制備而來(lái)。青紫薯色素是一種含原花青素的物質(zhì)，研究證實(shí)，它可以抑制氧化應(yīng)激對(duì)組織細(xì)胞的損傷，可有效清除超氧陰離子自由基、羥基自由基、過(guò)氧化亞硝基自由基和脂類(lèi)自由基，保護(hù)小鼠抗60Co γ?射線輻射所致的氧化損傷，減少氧自由基的產(chǎn)生，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，抑制腫瘤細(xì)胞形成等[5,6]。同時(shí)，還具有抗Fe2+引發(fā)的卵磷脂脂質(zhì)體過(guò)氧化、抑制H2O2引發(fā)的紅細(xì)胞溶血作用的能力[7]。本研究應(yīng)用最大給藥量試驗(yàn)及中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞(CHL)染色體畸變?cè)囼?yàn)，對(duì)青紫薯色素進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，為拓寬甘薯應(yīng)用領(lǐng)域及開(kāi)發(fā)系列產(chǎn)品提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　青紫薯色素凍干粉，由青島市農(nóng)技站提供，批號(hào)為20031129?2，溶于水，配制成200 g/L青紫薯色素水溶液。選擇昆明種小鼠60只，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄各半，體質(zhì)量為21～23 g。CHL細(xì)胞為置于-80 ℃或液氮凍存樣品。絲裂霉素C(MMC)、環(huán)磷酰胺(CTX)，山西泰盛制藥有限公司生產(chǎn)。肝微粒體酶(S9) 按常規(guī)方法制備。

　　1.2 方法

　　1.2.1 最大給藥量試驗(yàn)[8] 經(jīng)預(yù)試驗(yàn)后，選健康小鼠40只，體質(zhì)量21～23 g，雌雄各半。隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組和青紫薯色素組。禁食2 h后，青紫薯色素組小鼠灌胃給予200 g/L青紫薯色素水溶液，每次36 mL/kg，每天3次，間隔6 h，共21.6 g/(kg·d);空白對(duì)照組給予等量生理鹽水。兩組均連續(xù)給藥14 d，觀察小鼠的活動(dòng)狀態(tài)、飲食情況、糞便、呼吸，記錄體質(zhì)量變化及死亡情況。

　　1.2.2 染色體畸變?cè)囼?yàn) 以CHL細(xì)胞進(jìn)行加與不加S9 的染色體畸變?cè)囼?yàn)。陽(yáng)性對(duì)照為不加S9的MMC (0.1 mg/L),加S9的CTX(20 mg/L)。設(shè)青紫薯色素1.00、0.50、0.25 g/L等3個(gè)劑量組，以生理鹽水作為陰性對(duì)照組。每個(gè)測(cè)試組采用2個(gè)平行培養(yǎng)瓶。將5 ×104個(gè)CHL細(xì)胞接種于50 mL培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)72 h后,加入受試物。不加S9時(shí), 受試物與細(xì)胞作用24 h及48 h后,分別收獲細(xì)胞制片。而加S9時(shí),受試物、S9混合液與細(xì)胞共同作用6 h后,將液體棄去,用PBS洗滌細(xì)胞3次,加入新培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收獲細(xì)胞制片。常規(guī)制片, GIEMA染色。每一試驗(yàn)組每瓶選擇100個(gè)分散良好的中期分裂相,在油鏡下觀察染色體有無(wú)斷裂、缺失、易位、互換、環(huán)、多倍體等染色體畸變。

　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　結(jié)果用±s表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)。

　　2 結(jié)果

　　2.1 最大給藥量試驗(yàn)

　　小鼠灌服藥物14 d內(nèi),青紫薯色素組未出現(xiàn)毒性反應(yīng),體質(zhì)量增加，與生理鹽水對(duì)照組相比，差異無(wú)顯著性(P>0.05)，見(jiàn)表1。其外觀、行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、飲食、大小便及呼吸等均正常，無(wú)動(dòng)物死亡。

　　表1 青紫薯色素灌胃給藥對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響(略)

　　2.2 染色體畸變情況

　　不加S9青紫薯色素各劑量組CHL 細(xì)胞染色體的畸變率為1%～3%，其畸變類(lèi)型為斷裂和缺失，無(wú)明顯濃度依賴(lài)性;陰性對(duì)照組染色體畸變率2%，畸變類(lèi)型為微小體和斷裂;而陽(yáng)性對(duì)照組(MMC0.1 mg/L)染色體畸變率26%，畸變類(lèi)型以斷裂、斷片、缺失、微小體為主。

　　加S9青紫薯色素各劑量組CHL 細(xì)胞染色體畸變率均為2%，畸變類(lèi)型有斷裂、缺失、微小體;陰性對(duì)照組染色體畸變率1%，畸變類(lèi)型為交換;陽(yáng)性對(duì)照組(CTX 20 mg/L)的畸變率為27%，畸變類(lèi)型以斷裂、斷片、微小體為主。

　　無(wú)論是加S9組還是不加S9組，24 h還是48 h收獲細(xì)胞，不同劑量青紫薯色素組畸變率均<5%，根據(jù)CHL細(xì)胞染色體畸變結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，畸變率在正常范圍內(nèi)，為陰性;陽(yáng)性對(duì)照組畸變率>20%，為強(qiáng)陽(yáng)性。

　　3 討論

　　急性毒性試驗(yàn)是毒理學(xué)研究的第一步，急性毒性研究方法很多，常用的有半數(shù)致死量和最大給藥量試驗(yàn)。當(dāng)受試物的毒性很低，或者因濃度或體積的限制，無(wú)法測(cè)出LD50時(shí)，可僅提供最大給藥量試驗(yàn)的結(jié)果，以對(duì)藥物安全性進(jìn)行評(píng)估[8]。

　　本文在預(yù)試驗(yàn)中，因受藥物濃度和小鼠胃納量限制無(wú)法測(cè)出LD50，所以進(jìn)行多次最大給藥量試驗(yàn)。正式試驗(yàn)結(jié)果表明，青紫薯色素組每天3次灌胃給予小鼠青紫薯色素14 d，對(duì)動(dòng)物的體質(zhì)量增長(zhǎng)、進(jìn)食情況、行為活動(dòng)均無(wú)明顯影響，未發(fā)現(xiàn)因青紫薯色素蓄積而對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生毒性反應(yīng)。小鼠灌胃給予青紫薯色素21.6 g/(kg·d)，最大耐受劑量(MTD) 大于21 600 mg/kg ,按1977年頒布的化學(xué)物質(zhì)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，尤其是我國(guó)對(duì)職業(yè)性化學(xué)毒物危害程度的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)——中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB5044?85)，LD>5 000 mg/kg，為實(shí)際無(wú)毒物。由此確定青紫薯色素為實(shí)際無(wú)毒物。

　　化學(xué)物的致突變作用一般通過(guò)致突變?cè)囼?yàn)來(lái)篩檢[9]。CHL細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)是廣泛使用的遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)之一。可直接從染色體水平上反映遺傳物質(zhì)的損傷情況，染色體是遺傳單位基因的載體，具有獨(dú)特的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，當(dāng)受到外界誘變劑作用時(shí)出現(xiàn)損傷，形態(tài)及結(jié)構(gòu)上就會(huì)發(fā)生畸變。染色體畸變涉及的遺傳物質(zhì)改變的范圍比較大，一般可通過(guò)在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞有絲分裂中期相，計(jì)算畸變率來(lái)檢測(cè)。

　　本文CHL染色體畸變?cè)囼?yàn)應(yīng)用誘導(dǎo)劑處理后的S9進(jìn)行體外代謝活化試驗(yàn)，即在加S9mix和不加S9mix平行的條件下測(cè)試。觀察的畸變類(lèi)型有：斷裂、斷片、缺失、微小體、著絲點(diǎn)環(huán)、無(wú)著絲點(diǎn)環(huán)及各種輻射體等。試驗(yàn)結(jié)果顯示，直接誘變劑MMC(0.1 mg/L)組細(xì)胞染色體畸變率為26%，間接誘變劑CTX(20 mg/L)在S9活化條件下的畸變率為27%，均為強(qiáng)陽(yáng)性，畸變類(lèi)型主要有斷裂、斷片、缺失、微小體等。在S9活化和非活化兩種測(cè)試條件下，青紫薯色素在0.25～1.00 g/L濃度范圍內(nèi)，其誘發(fā)CHL細(xì)胞染色體畸變率<5%，在正常范圍，說(shuō)明對(duì)CHL 細(xì)胞染色體無(wú)損傷作用，即在本試驗(yàn)條件下無(wú)致突變作用。

　　綜上所述，青紫薯色素最大給藥量為21.6 g/(kg·d)，為實(shí)際無(wú)毒物。在0.25～1.00 g/L劑量范圍內(nèi)未見(jiàn)誘發(fā)CHL細(xì)胞染色體畸變率增高，無(wú)致突變作用。

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