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林可霉素生物合成技術(shù)
林可霉素生物合成技術(shù)
【摘要】在合成培養(yǎng)基中利用林可鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素。
當(dāng)向培養(yǎng)基中加入生物素和氨基酸時(shí)，林可霉素的產(chǎn)量受到很大影響。
【關(guān)鍵詞】林可霉素 生物合成
林可霉素是一種高效廣譜抗生素，臨床用于由抗革蘭陽性菌引起疾病的治療。
林可霉素A的分子式為C18H34N2O6S，分子量為406.56，它與林可霉素B在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別為：林可霉素A 4位上為正丙基，而林可霉素B4位上是乙基， 兩者在藥理上存在著很大的區(qū)別，林可霉素B的抑菌活性比林可霉素A低，但對(duì)人的毒副作用較大。
我國藥典要求成品中B含量小于5%。
本文采用合成培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，選擇玉米漿中含量較豐富的D�生物素、L�谷氨酸、L�纈氨酸等15個(gè)因子首先進(jìn)行兩水平因子設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以篩選出顯著影響因子，然后進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，通過軟件分析得到優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基配方。
一、 材料與方法
1、 菌種
林可鏈霉菌(Streptomyces lincolnensis)L�427，由江西國藥有限公司提供。
2 、 培養(yǎng)條件與培養(yǎng)方法
種子培養(yǎng)種子搖瓶于30℃，220r/min培養(yǎng)48h。
搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 按30%的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，220r/min，培養(yǎng)168h。
3、 生物效價(jià)的測定
采用管碟法。
鑒定菌為藤黃八疊球菌[Sarcina lutea，CMCC(B)28001]，由江西國藥有限責(zé)任公司提供。
林可霉素(lincomycin)標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。
二、結(jié)果與討論
1 、 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
通過兩水平因子設(shè)計(jì)(2 Level Factorial Design)實(shí)驗(yàn)可迅速找出生物素和氨基酸中對(duì)林可霉素的發(fā)酵生產(chǎn)有顯著影響的因子，進(jìn)一步對(duì)顯著影響因子進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)(response surface design，RSD)實(shí)驗(yàn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析可得到優(yōu)化配方。
所采用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析軟件為Design Expert 7.0。
(1)兩水平因子設(shè)計(jì) 該設(shè)計(jì)可從大量影響因子中快速找出顯著影響因子，設(shè)計(jì)方案和結(jié)果如表1所示。
用軟件進(jìn)行分析，得知設(shè)計(jì)模型的F值為18.05，由于噪聲影響而出現(xiàn)大于F值的概率僅為0.02%，故本設(shè)計(jì)模型是顯著的。
曲率的F值為19.62，出現(xiàn)比F值大的幾率僅為0.16%，說明模型的響應(yīng)曲面圖顯著彎曲，提示模型具有很強(qiáng)的顯著性。
鑒于此，選擇生物素、谷氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和酪氨酸作為影響發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素的關(guān)鍵因素，進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。
其他可信度較小的因素對(duì)林可霉素的發(fā)酵生產(chǎn)無顯著影響，在下一步的培養(yǎng)基優(yōu)化中不予考慮。
(2)響應(yīng)面設(shè)計(jì) 將6個(gè)顯著影響因子進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)中的中心組合設(shè)計(jì)(central composite design，CCD)，可得出響應(yīng)值(生物效價(jià))關(guān)于各顯著影響因子的多項(xiàng)二次擬合方程，再對(duì)響應(yīng)面進(jìn)行分析，可得響應(yīng)值與各因子之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，經(jīng)過綜合分析得出整個(gè)響應(yīng)區(qū)域中響應(yīng)值的最優(yōu)值和影響因子含量的最佳組合。
①中心組合設(shè)計(jì) 6個(gè)顯著影響因子D�生物素(a)、L�谷氨酸(b)、L�纈氨酸(c)、L�蛋氨酸(d)、L�亮氨酸(e)和L�酪氨酸(f)的濃度范圍分別為30～100μg/L，90～190、30～130、20～120、40～1400和20～120mg/L。
設(shè)計(jì)方案和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，“-1”、“0”和“1”分別表示對(duì)應(yīng)影響因子的最低濃度值、中間濃度值和最高濃度值。
軟件分析得知，模型的擬合度(R�Squared)為0.997，說明預(yù)測值與實(shí)測值之間具有高度的相關(guān)性;校正決定系數(shù)(Adj R�Squared)為0.9809，說明該模型能解釋98.09%響應(yīng)值(Titres)的變化,僅有總變異的1.91%不能用此模型來解釋;模型的信噪比(Adeq Precision)為23.723，一般來說，模型的信噪比大于4就是較好的模型，進(jìn)一步說明本模型設(shè)計(jì)是非常成功的。
�、诜治雠c優(yōu)化 利用軟件對(duì)生物效價(jià)預(yù)測值與顯著影響交互項(xiàng)ab、ac、ad、ae、af、bc、cd、ce、ef之間的響應(yīng)面圖進(jìn)行分析，得知上述交互作用項(xiàng)對(duì)生物效價(jià)的影響很大，在低濃度范圍內(nèi)，生物素濃度越低，生物效價(jià)的預(yù)測值越大;谷氨酸和纈氨酸之間、纈氨酸和亮氨酸之間以及亮氨酸和酪氨酸之間對(duì)生物效價(jià)的影響具有顯著的正協(xié)同效應(yīng);纈氨酸和蛋氨酸對(duì)生物效價(jià)的影響存在拮抗效應(yīng)，纈氨酸濃度較高和蛋氨酸濃度較低時(shí)，預(yù)測效價(jià)值較高。
對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行分析可知，低濃度的生物素對(duì)林可鏈霉菌的糖代謝、脂代謝和氨基酸代謝有促進(jìn)作用;林可鏈霉菌對(duì)谷氨酸的需求量較高，可能是因?yàn)槠鋮⑴c較多的脫氨基和轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，生成了較多的α�酮戊二酸等中間產(chǎn)物，一方面對(duì)三羧酸循環(huán)有強(qiáng)化作用，另一方面可為林可霉素的生成提供豐富的中間產(chǎn)物;纈氨酸和亮氨酸為分支氨基酸，它們脫氨基可生成支鏈脂肪酸，對(duì)林可鏈霉菌的生長有刺激作用;酪氨酸為林可霉素A合成的前體，補(bǔ)入適量的前體，可提高林可霉素A的合成速率和產(chǎn)量。
蛋氨酸為去甲基林可胺轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)的甲基供體，它對(duì)林可霉素的合成速率可能具有較大的限制作用，而纈氨酸對(duì)林可霉素的生長具有刺激作用，菌體生長與林可霉素的合成在某種程度上說是一種相互制約的關(guān)系，這樣就表現(xiàn)為蛋氨酸和纈氨酸之間的拮抗作用，而且林可霉素的合成要求有較高的菌濃，故培養(yǎng)基中應(yīng)適當(dāng)增加纈氨酸的濃度，相應(yīng)適當(dāng)降低蛋氨酸的濃度。
3 、 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
為了檢驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果的有效性，在搖瓶中同步進(jìn)行了優(yōu)化組、對(duì)照組I(培養(yǎng)基中無生物素和氨基酸)和對(duì)照組II(培養(yǎng)基中按原配方加入6個(gè)顯著影響因子)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。
三、結(jié)論
在化學(xué)合成培養(yǎng)基中用林可鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素，通過兩水平因子設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)生物素和氨基酸組分進(jìn)行篩選，得出六個(gè)對(duì)生物效價(jià)有顯著影響的因子：D�生物素、L�谷氨酸、L�纈氨酸、L�蛋氨酸、L�亮氨酸和L�酪氨酸;通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和軟件的優(yōu)化分析得到上述六個(gè)顯著影響因子的含量分別為30μg/L及100.5、83、29、117.5和58.5mg/L時(shí)，最終發(fā)酵液的最大預(yù)測效價(jià)為2275μg/ml。
采用優(yōu)化配方進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，最終發(fā)酵液的生物效價(jià)為2116μg/ml;而采用對(duì)照I和II配方進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，最終發(fā)酵液的生物效價(jià)分別為893和1481μg/ml，即采用優(yōu)化配方相對(duì)于采用對(duì)照I和II配方在生物效價(jià)方面提高的百分含量分別為136.62%和42.88%。
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