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物流開題報告畢業(yè)論文參考
研究背景眼科最常見致盲眼病有白內(nèi)障、青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變和黃斑病等，其中青光眼是繼白內(nèi)障后的第二致盲原因，我國青光眼的發(fā)病率為0.52%，患病人數(shù)約為700萬。xx年資料顯示世界青光眼發(fā)病人數(shù)到xx年將達(dá)到7000萬，雙眼盲目人數(shù)達(dá)到840萬(quigley et al.，xx)。眾多的青光眼患者和青光眼盲者，不僅給患者帶來極大的身心痛苦，而且還造成社會和經(jīng)濟的巨大負(fù)擔(dān)，因此，預(yù)防、控制及治療青光眼十分重要且迫切!青光眼是一種由于病理性眼壓增高導(dǎo)致的具有特征性視神經(jīng)結(jié)構(gòu)損傷和視野缺損為表現(xiàn)的神經(jīng)性退行性視神經(jīng)病變，其最終的結(jié)局是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(rgcs)凋亡、視功能逐漸喪失(buckingham et al.，xx)。目前已有大量保護rgcs的研究結(jié)果，主要包括：改善視乳頭微循環(huán)、谷氨酸途徑抑制劑、神經(jīng)營養(yǎng)因子，誘導(dǎo)熱休克蛋白表達(dá)及抗氧化治療等。然而，青光眼的發(fā)病機制至今尚未完全闡明。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體通道研究在rgcs損傷與保護中的作用近年來正得到關(guān)注。最新的研究方向和靶點之一是關(guān)于能感受壓力的受體通道可能參與傳遞病理刺激造成神經(jīng)損傷(quigley et al.，xx)。trpc6(transient receptor potential，c6)是一個新發(fā)現(xiàn)的、壓力敏感、參與神經(jīng)元存活與凋亡的鈣離子通透膜通道蛋白。本人曾參與課題"trpc6通道在視網(wǎng)膜缺血再灌模型中對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)的保護作用"的研究，并獲得了有價值的前期研究結(jié)果：較為全面而精確的定位了trpc6通道基因和蛋白在sd大鼠視網(wǎng)膜、尤其是rgcs上的表達(dá)和分布，trpc6在rgc層上有選擇性的高表達(dá);探討了trpc6在大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌(ischemia reperfusion,ir)損傷過程中的表達(dá)變化，trpc6基因和蛋白在視網(wǎng)膜缺血損傷中的再灌注后24小時，出現(xiàn)一過性的表達(dá)升高;在體的藥理學(xué)實驗結(jié)果顯示，其激動劑oag具有保護視網(wǎng)膜ir模型誘導(dǎo)的rgcs免受損傷，而拮抗劑skf96365則促進了rgcs凋亡的發(fā)生，本研究擬進一步探討trpc6的作用機制。研究發(fā)現(xiàn)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,bdnf)與trpc通道在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控細(xì)胞存活的過程中有密切的聯(lián)系。xx年4月中國科學(xué)院上海神經(jīng)科學(xué)研究所王以政研究員課題組在nature neuroscience上發(fā)表論文，首次證實過表達(dá)trpc6/trpc3可保護小腦神經(jīng)元對抗因血清剝奪而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，且發(fā)現(xiàn)bdnf位于trpc3/6介導(dǎo)的細(xì)胞保護信號通路的上游(tai et al.，xxa;jia et al.，xx)。本課題擬探討bdnf介導(dǎo)trpc6通道蛋白保護視網(wǎng)膜跟模型誘導(dǎo)的rgcs免受損傷的作用機制，對深入闡明青光眼的發(fā)病機制，為臨床干預(yù)治提供新的思路和藥物干預(yù)靶點，具有一定的現(xiàn)實意義。本課題的研究主要分為以下二部分：第一部分視網(wǎng)膜ir模型中調(diào)控trpc通道時bdnf的表達(dá)變化一、研究目的在sd大鼠視網(wǎng)膜ir模型中檢測bdnf基因不同再灌注時間點的表達(dá)變化，同時檢測抑制trpc通道時bdnf蛋白水平變化、探討其表達(dá)類型對rgcs凋亡的影響。
二、研究方法：
1、在視網(wǎng)膜ir模型中檢測bdnf基因的表達(dá)。采用視神經(jīng)血管鉗夾法建立視網(wǎng)膜ir模型，夾閉視網(wǎng)膜血供60分鐘，分別于再灌注后3小時、24小時、48小時、7天處死大鼠，摘取眼球，顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜，提取視網(wǎng)膜總rna，利用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)及實時熒光定量pcr(real-time pcr)測定bdnf基因表達(dá)變化。
2、抑制trpc通道時檢測bdnf蛋白的表達(dá)。建立大鼠視網(wǎng)膜ir模型，于視網(wǎng)膜缺血術(shù)前30分鐘，右眼通過玻璃體腔注射trpc拮抗劑skf96365為實驗組，左眼注射溶劑pbs為陰性對照組，分別于再灌后3小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時處死大鼠，摘取眼球，顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜，提取視網(wǎng)膜總蛋白，蛋白質(zhì)免疫印跡(western blot)檢測bdnf在視網(wǎng)膜組織中的蛋白表達(dá)水平。
3、抑制trpc通道時檢測bdnf基因的表達(dá)。將sd大鼠分為4組，分別進行如下處理：第一組，對眼球進行假手術(shù)，只行視神經(jīng)分離術(shù)，不行視網(wǎng)膜缺血手術(shù);第二組，建立視網(wǎng)膜ir模型;第三組于視網(wǎng)膜缺血術(shù)前30分鐘，通過玻璃體腔注射pbs溶液，然后再建立視網(wǎng)膜ir模型;第四組于視網(wǎng)膜缺血術(shù)前30分鐘，通過玻璃體腔注射注射skf96365，然后再建立視網(wǎng)膜ir模型。所有大鼠于再灌注后24小時處死，摘取眼球，顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜，提取視網(wǎng)膜總rna，real-time pcr測定bdnf基因表達(dá)變化。
三、研究結(jié)果rt-pcr及real-time pcr結(jié)果顯示bdnf mrna在再灌注后3小時開始出現(xiàn)升高，24小時出現(xiàn)表達(dá)高峰，是對照組的1.4倍(p<0.05，n=6);western blot結(jié)果顯示應(yīng)用skf96365抑制trpc通道后，bdnf的前體蛋白(precursor for bdnf，probdnf)表達(dá)量升高，并于再灌注后24小時達(dá)到高峰，是對照組的1.4倍(p<0.05，n=6)，而成熟型bdnf(mature bdnf，mbdnf)在整個再灌注過程中未見明顯變化。缺血再灌注24小時，ir+skf96365組bdnf的基因表達(dá)水平分別是假手術(shù)組、ir組、ir+pbs組的2.7、1.7、1.4倍，與ir+pbs組有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05，n=6)。
四、小結(jié)在ir模型中，bdnf基因的時間表達(dá)譜早于trpc6(trpc6的mrna水平在再灌后是12小時開始升高)，提示bdnf可能位于trpc6介導(dǎo)的細(xì)胞保護作用的上游。當(dāng)trpc通道受到抑制時，bdnf的基因水平和probdnf蛋白水平都升高，表明bdnf的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都有提高，但mbdnf沒有變化，提示trpc通道反饋性影響bdnf翻譯后修飾的過程。第二部分probdnf-p75ntr信號通路在視網(wǎng)膜ir模型誘導(dǎo)的rgcs損傷中的作用：
一、研究目的探索p75ntr信號通路在視網(wǎng)膜ir誘導(dǎo)的rgcs損傷中的作用。
二、研究方法使用熒光金(fluorogold，fg)通過上丘注射對活體sd大鼠rgcs進行逆行標(biāo)記，在充分標(biāo)記后(7天)，建立視網(wǎng)膜ir損傷模型，于視網(wǎng)膜缺血術(shù)前30分鐘通過右眼玻璃體腔注射p75ntr信號通路拮抗劑tat-pep5進行干預(yù)，且同時左眼注射溶劑dmso為陰性對照，分別于再灌后24小時、48小時、72小時、7天處死大鼠，常規(guī)心臟灌流取視網(wǎng)膜，平鋪后熒光顯微鏡下行rgcs計數(shù)，對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。
三、研究結(jié)果統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，在再灌注后48小時，玻璃體腔注射p75ntr信號通路拮抗劑tat-pep5組較之注射溶劑dmso對照組顯著增加rgcs的數(shù)目(p<0.05，n=6)。
四、小結(jié)在ir模型中probdnf-p75ntr信號通路可能參與抑制trpc通道誘導(dǎo)的促進rgcs死亡的過程。結(jié)論本研究提示bdnf可能是trpc6通道蛋白保護視網(wǎng)膜ir模型誘導(dǎo)的rgcs免受損傷的上游通路，當(dāng)trpc通道受到抑制時，能反饋性影響bdnf轉(zhuǎn)錄后翻譯修飾的過程，導(dǎo)致probdnf量的累積，提高與p75ntr受體結(jié)合率，從而誘導(dǎo)促進rgcs死亡。這一發(fā)現(xiàn)有助于增進我們對青光眼發(fā)病機制的認(rèn)識和研究，并為臨床上進行藥物干預(yù)和治療提供新的思路和途徑。
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