青枯菌病理研究進(jìn)展報(bào)告

　　摘要：細(xì)菌性青枯病危害多種作物,抗病育種是病害防治最為可行的途徑,ＤＮＡ分子標(biāo)記研究是深化作物青枯病抗性遺傳改良的重要方面。生防研究近幾年也取得了較大的進(jìn)展，本文著重從這兩個(gè)方面對(duì)青枯病的研究做一綜述。

　　關(guān)鍵詞：青枯菌 生化變種 致病機(jī)理 分子標(biāo)記

　　青枯病是一種由青枯菌(Ralstonia dolaanacearum)引起的毀滅性土傳病害，發(fā)病植物莖葉萎蔫下垂直至全部枯死，是世界上危害最大、分布最廣、造成損失最嚴(yán)重的植物病害之一，至今尚沒(méi)有有效的化學(xué)農(nóng)藥和其他防治辦法。因此青枯病被稱為植物的“癌癥”。植物青枯菌R.. dolaanacearum可侵染40多個(gè)科200多種植物, 僅次于農(nóng)桿菌(Agrobacterium tu me faciens)。是番茄、馬鈴薯、花生、甘薯、煙草、辣椒、茄子、生姜、草莓、香蕉以及一些貴重藥材和花卉植物許多植物生產(chǎn)的重要限制因素,世界各地均有分布。青枯病菌是一個(gè)復(fù)雜的群體，有明顯的生理分化，不同地區(qū)和不同寄主來(lái)源的菌株，在寄主范圍、致病力、生化型、血清型等細(xì)菌學(xué)特性上差異很大，因此增加了對(duì)此病害防治研究的難度。近幾年來(lái)許多科研工作者從不同的角度不同方法對(duì)青枯菌進(jìn)行了多方面的研究。

　　1 青枯菌菌系的組成

　　青枯菌生理生化復(fù)雜，各國(guó)的科學(xué)家都對(duì)其進(jìn)行了種以下的分類或分型的各種嘗試。有兩個(gè)亞分類系統(tǒng)已被國(guó)際所公認(rèn)。一是按不同來(lái)源菌株對(duì)不同植物種類的致病性差異，將青枯菌劃分為不同的生理小種（Race）。60年代已命名4個(gè)小種：小種1號(hào)（可侵染茄科植物和其他科植物），小種2號(hào)（只侵染香蕉、大蕉和Heliconia），小種3號(hào)（只侵染馬鈴薯，偶爾侵染番茄和茄子），小種4號(hào)（只對(duì)姜致病力很強(qiáng)）。另一個(gè)亞分類系統(tǒng)是根據(jù)不同菌株對(duì)三種雙糖（麥芽糖、乳糖、和纖維二糖）和三種乙醇（甘露醇、山梨醇和衛(wèi)矛醇）氧化產(chǎn)酸能力的差異將青枯菌化分為4個(gè)生化變種：生化變種1（不能氧化3種雙糖和3種乙醇），生化變種2（只能氧化3種雙糖，不能氧化3種乙醇），生化變種3（能氧化3種雙糖和3三種乙醇），生化變種4（只能氧化3種乙醇，不能氧化3種雙糖）。生理小種和生化變種的關(guān)系是這樣的：生理小種1號(hào)中包含生化變種1、3和4。生理小種2號(hào)中包含生化變種1和3。生理小種3號(hào)中包含生化變種2。生理小種4號(hào)中包含生化變種4。但是，從桑樹(shù)分離的一些菌株與以往確定菌系種力不同，其對(duì)幾種代表行茄科植物的致病力很弱或不致病，而且它們具有氧化3種雙糖和甘露醇的能力，因而鑒定為一種新菌系，命名為小種5號(hào)和生化變種5號(hào)。[1] 國(guó)內(nèi)現(xiàn)在只發(fā)現(xiàn)小種1號(hào)和小種3號(hào)。小種1號(hào)是我國(guó)長(zhǎng)江流域及其以南地區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌系，小種3號(hào)是危害我國(guó)馬鈴薯的優(yōu)勢(shì)菌系，對(duì)我國(guó)的馬鈴薯生產(chǎn)產(chǎn)生重大的威脅。對(duì)大量青枯菌的檢測(cè)結(jié)果表明，青枯菌存在菌細(xì)單抗特異性，但目前還不能根據(jù)這種單抗特異性對(duì)青枯菌菌系間進(jìn)行實(shí)質(zhì)性的親緣關(guān)系的亞分類和分群模式。[2]

　　2 青枯菌的致病機(jī)理

　　研究證明，青枯菌通�？蓮闹参锔�部或莖部的傷口侵入，引起發(fā)病。但在天然條件下，也能從沒(méi)有受傷的次生根的根冠部位侵入。植物生長(zhǎng)時(shí)在次生根的根冠和主根的表皮間形成鞘，青枯菌能穿過(guò)這層鞘，侵入皮層細(xì)胞間隙生長(zhǎng)，破壞細(xì)胞間中膠層，使細(xì)胞壁分離，變形，形成空腔，繼而侵染，木質(zhì)部薄壁組織使導(dǎo)管附近的小細(xì)胞受刺激形成侵填體，并移入侵填體，侵填體破裂后繼被釋放進(jìn)入導(dǎo)管，并在導(dǎo)管內(nèi)大量繁殖和快速傳播擴(kuò)張，從而引起植株萎蔫死亡。植物病害生理研究證明：青枯菌在導(dǎo)管中生長(zhǎng)時(shí)可產(chǎn)生大量的胞外多糖，其影響和阻礙植物體內(nèi)的水分運(yùn)輸特別是容易對(duì)葉柄結(jié)和小葉處較小孔徑導(dǎo)管穿孔板造成堵塞。因而引起植株枯萎;同時(shí)，青枯菌還可以分泌于細(xì)胞外多種細(xì)胞壁降解酶（如果膠酶類和纖維素酶類）其可能也在破壞導(dǎo)管組織。青枯菌在人工培養(yǎng)時(shí)還能分泌一些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)如IAA，CTK和Eth等但現(xiàn)有資料表明它們?cè)谥参矬w內(nèi)的產(chǎn)量有限。對(duì)植物死亡方面的作用尚不清楚，而且研究也少。國(guó)外的研究大量集中在胞外多糖，果糖酶和纖維素酶在致病過(guò)程中的作用。美國(guó)威斯康星大學(xué)Sequeira實(shí)驗(yàn)室（1991） 報(bào)道克隆出了控制胞外多糖和脂多糖的基因簇eps A-D或ops-A-D。佐治亞大學(xué)Denny實(shí)驗(yàn)室克隆出了控制胞外多糖等表型轉(zhuǎn)變的基因phc A。后證明是復(fù)合調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)（Complex regulatory networks,CRN）控制胞外多糖的產(chǎn)量，控制對(duì)某些環(huán)境或信號(hào)的反應(yīng)還可控制其他致病因素。黃勇和Sequeira報(bào)道了從青枯菌株K 60(小種1號(hào),生化變種1)分離到hrp基因簇，目前，還未能從寄主植物上找到跟hrp相對(duì)應(yīng)的抗病基因。[3]馬慶生等克隆出了青枯菌對(duì)花生的�；�性基因。[4]最近又有報(bào)道已經(jīng)克隆出了青枯菌的抗病基因。

　　3 青枯病抗性的分子標(biāo)記

　　3．1茄科蔬菜的青枯病抗性

　　茄科植物受青枯病危害最重,涉及的作物種類最多,從世界范圍內(nèi)的寄主植物看,有關(guān)青枯病研究工作開(kāi)展最多的也是茄科植物,尤其以番茄和馬鈴薯青枯病的研究最為普遍,其次為煙草。但是茄科蔬菜類及馬鈴薯作物等目前發(fā)現(xiàn)的青枯病抗性種質(zhì)較少而且抗性水平不高,抗性表現(xiàn)受環(huán)境影響較大,抗病品種選育受到限制,是國(guó)內(nèi)外面對(duì)的一大難題。在番茄中至今沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯性寡基因控制的青枯病抗性,已有抗性種質(zhì)的抗性多表現(xiàn)為數(shù)量遺傳特性,抗性位點(diǎn)多造成了抗性遺傳的復(fù)雜性。[5]

　　3.1.1番茄的青枯病抗性分子標(biāo)記

　　目前關(guān)于植物青枯病抗性分子標(biāo)記的報(bào)道主要是對(duì)番茄的研究。盡管番茄栽培品種之間的DNA多態(tài)性不高,但番茄具備良好的遺傳系統(tǒng),易于操作[6]。在番茄的青枯病抗性研究中,既發(fā)現(xiàn)了廣譜性位點(diǎn),也發(fā)現(xiàn)了對(duì)某些菌系具有�；�性的抗性位點(diǎn)。 Danesh等研究認(rèn)為在番茄第6、7、10染色體上存在與青枯病抗性相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)[7]。亞洲蔬菜研究與發(fā)展中心(AVRDC)Wang等研究證實(shí)了Hawaii7996(番茄中廣泛應(yīng)用的抗源)在第6條染色體上的抗性標(biāo)記,并發(fā)現(xiàn)在第3和第8條染色體上存在抗性位點(diǎn),還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)未定位的RAPD標(biāo)記Ｋ4ａ[8]。Yui等研究獲得了Hawaii7996青枯病抗性的4個(gè)RAPD標(biāo)記,在99個(gè)Ｆ2植株中鑒定出32株具有全部4個(gè)RAPD標(biāo)記,其中2個(gè)標(biāo)記(RA12-12450和RA12-291600)被認(rèn)為與抗性主效基因連鎖[9]。Mangin等研究認(rèn)為在番茄第6條染色體上至少有2個(gè)獨(dú)立的位點(diǎn)與青枯病抗性有關(guān)[10]。

　　3.2花生青枯病抗性種質(zhì)研究

　　花生在青枯菌寄主植物的抗性遺傳多樣性中有特殊地位。到2000年,世界范圍內(nèi)鑒定出高抗青枯病的花生地方品種超過(guò)120個(gè),二倍體野生花生中也發(fā)現(xiàn)了20多份抗青枯病材料,這是其它茄科植物不可比擬的,就數(shù)量而言,花生屬植物抗性種質(zhì)的遺傳豐富性居青枯菌寄主植物首位。自20世紀(jì)初印度尼西亞首次發(fā)現(xiàn)抗青枯病花生種質(zhì)以來(lái),歷經(jīng)近100年,這些最早發(fā)現(xiàn)的抗病材料仍然具有很高的抗性(群體存活率)。與茄科作物相比,花生的青枯病抗性水平不僅更高,而且穩(wěn)定性更強(qiáng)[11]。

　　3.2.1花生青枯病抗性遺傳及DNA標(biāo)

　　3.2.2記研究

　　據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果,花生青枯病抗性在遺傳上受寡基因控制,如珍珠豆型花生的抗性受2對(duì)主效基因控制。育種實(shí)踐表明,花生青枯病抗性容易在品種間轉(zhuǎn)移,也易于從二倍體野生種轉(zhuǎn)移到四倍體栽培種中,如河南省農(nóng)科院和中國(guó)農(nóng)科院油料所均從二倍體野生花生轉(zhuǎn)移獲得了抗青枯病品系。廖伯壽等研究證明花生對(duì)青枯菌潛伏侵染反應(yīng)特性存在遺傳分化[11,12]。從2000年起,中國(guó)與國(guó)際半干旱研究所合作開(kāi)展了花生青枯病抗性的分子標(biāo)記及輔助選擇技術(shù)研究,發(fā)現(xiàn)了不同花生抗病基因型間的AFLP和SSR多態(tài)性,建立了青枯病抗性的重組近交系(RI)群體,將用于繪制遺傳連鎖圖譜和基因定位�；ㄉ�青枯病抗性遺傳基礎(chǔ)較為簡(jiǎn)單,為分子標(biāo)記的建立乃至基因的克隆提供了可行性。

　　3.2.3花生青枯病抗性的利用潛力

　　由于花生在對(duì)青枯病的抗性水平、穩(wěn)定性和抗性遺傳基礎(chǔ)上的特殊性,研究和分離抗性基因?qū)τ谄渌�作物青枯病抗性改良具有重要的潛在作�?1997年在法國(guó)召開(kāi)的第二屆國(guó)際植物青枯病大會(huì)(IBWS)對(duì)此提出了倡議。通過(guò)研究建立花生青枯病抗性的分子標(biāo)記,可以明確抗性基因位點(diǎn),估計(jì)抗性基因作用、遺傳特性及環(huán)境影響,最終克隆和分離抗性基因,對(duì)于深化花生乃至其它作物的青枯病抗性育種具有重要的理論和實(shí)用意義。國(guó)際花生青枯病工作網(wǎng)(GBWWG)正利用多邊合作關(guān)系開(kāi)展工作,以期在花生和其它植物青枯病抗性改良上取得突破。

　　4 青枯菌生防菌的研究

　　4．1青枯生防菌Bacillus sp

　　青枯生防菌 Bacillus sp。B130菌株是姜瘟靈的主要有效成分，它對(duì)包括青枯菌在內(nèi)的多種植物病原真菌和細(xì)菌有明顯的拮抗作用．B130能在PH5～8之間較快地生長(zhǎng)，以 PH 6時(shí)菌體生長(zhǎng)狀況為最佳，抑菌活性亦最強(qiáng)．培養(yǎng)初期抑菌活性隨培養(yǎng)時(shí)間而增長(zhǎng)，但 36 h后呈下降趨勢(shì)。對(duì)蛋白粗提液等的研究表明，B130的抑菌物質(zhì)成分復(fù)雜，但主要活性部分是蛋白和多肽類物質(zhì)．[13]

　　4．2青枯病生防菌ANTI－8098A

　　福建農(nóng)科院研究員劉波博士主持的《農(nóng)作物青枯病生防菌ANTI－8098A的研究與應(yīng)用》項(xiàng)目經(jīng)過(guò)8年努力，篩選獲得了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的植物青枯病生防菌株ANTI－8098A，經(jīng)德國(guó)菌種保存中心鑒定為蠟狀芽孢桿菌。在完成菌株的生物學(xué)特性研究的基礎(chǔ)上，項(xiàng)目組自行設(shè)計(jì)并完成了生防菌劑中試規(guī)模的網(wǎng)絡(luò)監(jiān)控生物反應(yīng)系統(tǒng)，建立了菌劑生物測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化方法，成功研制出生防菌的存活基質(zhì)、菌劑生產(chǎn)工藝和保質(zhì)技術(shù)，解決了菌劑田間定殖難題。經(jīng)科學(xué)測(cè)定，ANTI－8098A青枯病生防菌劑幾年來(lái)在福建不同地區(qū)的茄科作物上推廣面積達(dá)5.6萬(wàn)畝次，對(duì)番茄、茄子、辣椒、花生、煙草、生姜等作物青枯病田間防效高達(dá)75％－85％，與普通化學(xué)農(nóng)藥相比，價(jià)格低，效果好，不造成藥害，不污染環(huán)境，農(nóng)藥殘留不超標(biāo)，經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益良好。專家認(rèn)為，這項(xiàng)研究首次發(fā)現(xiàn)了ANTI－8098A對(duì)青枯菌的致弱現(xiàn)象，即將青枯雷爾氏菌強(qiáng)致病力菌株轉(zhuǎn)化為無(wú)致病力菌株，從而抑制病害。項(xiàng)目組對(duì)致弱機(jī)理進(jìn)行了探索性研究，建立了PCR電泳、紫外分光、液相色譜、異源吸附蛋白、TTC培養(yǎng)基測(cè)定、寄主植物回接等致弱作用的檢測(cè)方法，為植物青枯病生物防治機(jī)理研究提供了新思路。[14]

　　4．3 eep( export of extracellular proteins)突變體

　　4．3 .1 eep缺失突變體的致病力

　　通過(guò)Tn5誘變技術(shù)，分離了植物青枯病菌生理小種1號(hào)、3號(hào)的胞外蛋白輸出功能喪失突變體。由于Tn5在其基因組單一的eep位點(diǎn)的插入，突變體失去了向培養(yǎng)液分泌產(chǎn)生胞外酶和胞外蛋白質(zhì)的能力。用堿性磷酸酯酶基因PhoA作為報(bào)導(dǎo)基因，研究這些胞外蛋白穿越突變體細(xì)胞內(nèi)膜，結(jié)果表明，[16]這些胞外蛋白質(zhì)可以穿過(guò)其內(nèi)膜，但失去了穿越其外膜的能力。胞外多糖在植物體內(nèi)和體外的產(chǎn)生沒(méi)有受到eep基因位點(diǎn)突變的影響。該突變體失去了對(duì)番茄植株的致萎能力。

　　4．3 .2 eep突變體防治番茄青枯病的研究

　　室溫內(nèi)，采用土壤接種的方法將野生型青枯菌AW和PO41接種于競(jìng)爭(zhēng)其滅菌的土壤內(nèi)（AW 、PO41 菌懸液3 ×108細(xì)菌/ml）。同時(shí)采用浸苗法，分別把突變株AD4、AP7和熒光假單胞菌菌株JF1接種番茄幼苗。結(jié)果表明在接種初期，菌株AD4、AP7和JF1都有防治番茄青枯病的能力，但在接種20天后，只有eep突變體AD4具有生防效果。[15]

　　不同菌株室溫內(nèi)防治番茄青枯病結(jié)果（病株率%）

　　菌株 移栽后天數(shù)

　　5 10 15 20 30

　　AD4 AP7 JF1 CK0 0 0 3015 30 20 7520 65 80 10020 35 70 80 100 100 100 100

　　在田間，AD4對(duì)番茄青枯病的防治效果不如室溫明顯，但在接種后的1個(gè)月內(nèi)仍有一定的防治效果，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，效果下降。AD4同以往各類青枯菌的不同點(diǎn)，在于它在失去對(duì)寄主的致病力后仍具有較好的寄主親和力。這為生物防治提供了很好的微生物資源。

　　5 展望

　　相對(duì)于其它許多植物病害而言,植物青枯病抗性的DNA分子標(biāo)記研究較少,除番茄之外,其它作物處于起步階段。由于眾多茄科作物中發(fā)現(xiàn)的高抗種質(zhì)很少,發(fā)掘新的基因和實(shí)現(xiàn)不同抗性位點(diǎn)的聚合是提高抗性水平的重要方面�；ㄉ�抗青枯病資源豐富,抗性的遺傳行為較為簡(jiǎn)單,抗性ＤＮＡ分子標(biāo)記的建立必將推動(dòng)花生及其它作物抗性育種的進(jìn)步。我國(guó)具有微生物的資源優(yōu)勢(shì)，利用細(xì)菌病毒防治植物青枯病害有著美好的前景，隨著生物技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用，一批利用遺傳工程改造的高效生防菌逐一問(wèn)世，這將大大推動(dòng)對(duì)植物青枯病害的研究

　　不久的將來(lái)，植物青枯病將不再是植物生長(zhǎng)的“克星”。

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